dan Daya Hidup Mikroorganisme Rumen
3.1.1 Aktivitas antibakteri Tepung Daun Sirih Terhadap Staphylococcus sp. Perlakuan level tepung daun sirih dalam ransum berpengaruh nyata (P<0.05) pada pengujian daya hambat terhadap Staphylococcus sp. sebelum fermentasi. Hasil pengujian aktivitas antibakteri tepung daun sirih dengan level 0, 2, 4, 6, dan 8% dalam masing-masing menghasilkan diameter hambat 0.0, 3.9, 15.9, 18.1, dan 22.0 mm. Diameter hambat tersebut seiring dengan penambahan level tepung daun sirih (Tabel 2). Adanya diameter hambat tersebut diakibatkan oleh zat aktif yang terkandung dalam daun sirih yang bersifat antibakteri.
Tabel 3 Rataan diameter zona hambat tepung daun sirih terhadap bakteri Staphylococcus sp.
Pra Fermentasi Rumen Pasca Fermentasi Rumen Level Tepung Daun Sirih (%) Diameter Hambat (mm) Level Tepung Daun Sirih (%) Diameter Hambat (mm) 0 0.0 ± 0.0a 0 0.0 ± 0.0a 2 3.9 ± 3.62a 2 16.1 ± 1.92b 4 15.9 ± 3.64b 4 15.3 ± 1.64b 6 18.1 ± 1.40bc 6 15.8 ± 1.14b 8 22.0 ± 2.88c 8 14.6 ± 0.87b a
Angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji selang berganda Duncan).
Percobaan Hermawan (2007), mengenai pengaruh ekstrak daun sirih hijau (Piper betle L.) terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dengan metode difusi disk diperoleh kesimpulan bahwa ekstrak daun sirih hijau (Piper betle L.) mampu menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli yang ditunjukkan dengan adanya zona bening yang terbentuk pada media uji yang dapat diukur. Selanjutnya Benchaar et al. (2008) melaporkan bahwa carvacrol yang terkandung dalam minyak atsiri dapat membunuh Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa.
13 Setelah dilakukan fermentasi in vitro, level 2% menghasilkan diameter hambat tertinggi di antara perlakuan (tepung daun sirih dalam konsentrat), demikian pula bila dibandingkan dengan kontrol (0 %). Sedangkan perlakuan 4, 6, dan 8% menghasilkan diameter zona bening yang sama pasca fermentasi yaitu masing-masing berturut-turut 15.3, 15.8, dan 14.6 mm. Peningkatan diameter zona hambat perlakuan 2% setelah fermentasi diduga disebabkan oleh terlepasnya zat aktif dalam proses fermentasi sehingga potensi untuk membunuh bakteri menjadi lebih tinggi. Sedangkan penurunan diameter zona hambat pada perlakuan 4, 6, dan 8% disebabkan oleh adaptasi bakteri rumen ketika level ditingkatkan sehingga aktivititas antibakteri daun sirih menurun setelah fermentasi. Penurunan tersebut disebabkan oleh degradasi minyak atsiri di dalam rumen. McIntosh et al. (2003) melaporkan bahwa terjadi resistensi dan sensitivitas pada bakteri rumen ketika ditumbuhkan pada media yang mengandung minyak atsiri.
3.1.2 Pengaruh Penambahan Tepung Daun Sirih Terhadap Produksi Volatile Fatty Acid (VFA)
Hasil pengukuran VFA total terhadap pada fermentasi in vitro dengan pemberian rumput gajah dan konsentrat sapi perah yang ditambahkan dengan tepung daun sirih dengan level yang berbeda dapat dilihat pada Gambar 1. Penambahan level tepung daun sirih memberikan pengaruh yang nyata (P<0.05) terhadap rata-rata produksi VFA total di antara perlakuan. Kadar VFA yang tertinggi yaitu pada perlakuan 2%, tetapi kadar VFA menurun seiring dengan penambahan level tepung daun sirih pada level 4, 6, dan 8%.
Penurunan kadar VFA total pada perlakuan 4, 6, dan 8% disebabkan oleh kandungan zat aktif antibakteri dari daun sirih yang lebih banyak. Salah satu kandungan zat aktif yang dominan dan memiliki kemampuan menghambat bakteri adalah eugenol (Benchaar et al. 2007). Lebih lanjut Benchaar et al. (2008)
Gambar 1 Rataan Produksi VFA total pada fermentasi in vitro rumput gajah dengan konsentrat yang ditambahkan tepung daun sirih dengan level yang berbeda.
14 mengemukakan bahwa eugenol minyak atsiri tidak berpengaruh terhadap konsentrasi VFA total kecuali pada dosis yang tinggi. Penggunaan pada dosis tinggi dapat menurunkan konsentrasi VFA total. Castillejos et al. (2006) melaporkan bahwa eugenol dan thymol menurunkan total konsentrasi VFA dan mengubah profil VFA, selanjutnya penggunaan eugenol 500 mg/L mengubah profil VFA dengan meningkatkan proporsi propionat sebesar 31%.
Senyawa aktif thyme, oregano, cinnamon juga dapat mempengaruhi ekologi rumen dengan menghambat perkembangan bakteri pendegradasi serat khususnya Fibrobacter succinogenes dan Ruminococcus flavefaciens sehingga dapat menurunkan produk fermentasi jika penggunaannya dalam jumlah yang besar (Lin et al. 2012). Pada level tertentu penambahan tepung daun sirih dapat memberikan efek positif dan dan efek negatif. Pada level yang tinggi tepung daun sirih dapat membunuh bakteri dan pada level yang rendah dapat memodulasi dan berinteraksi dengan bakteri. Peningkatan bakteri rumen dapat berpengaruh positif terhadap produksi VFA dan produk fermentasi lainnya, sehingga penggunaannya pada ternak ruminansia perlu dioptimalkan untuk hasil yang lebih baik.
3.1.3 Pengaruh Penambahan Tepung Daun Sirih Terhadap Produksi Amonia (NH3)
Hasil pengukuran produksi NH3 terhadap fermentasi in vitro dengan rumput gajah dan konsentrat sapi perah yang ditambahkan dengan tepung daun sirih dapat dilihat pada Gambar 2. Hasil penelitian menunjukkan tidak terdapat pengaruh yang nyata terhadap rataan kadar NH3 dengan pemberian tepung daun sirih.
Penggunaan 2% tepung daun sirih dalam konsentrat cenderung meningkatkan kadar NH3 (10.17 mM) dibandingkan dengan kontrol (9.88 mM) (Gambar 2). Pada level 4, 6, dan 8% cenderung lebih rendah dari pada kontrol, masing-masing menghasilkan rataan NH3 yaitu 9.65 mM, 9.02 mM, dan 8.62 mM. Benchaar et al. (2008) melaporkan bahwa saat ini beberapa penelitian telah menunjukkan faktor seperti komposisi kimia dan dosis minyak atsiri dapat mempengaruhi minyak atsiri terhadap metabolisme N rumen.
Gambar 2 Rataan kadar NH3 pada fermentasi in vitro rumput gajah dengan konsentrat yang ditambahkan tepung daun sirih dengan level yang berbeda.
15
Faktor yang menyebabkan penurunan kadar NH3 pada penggunaan tepung daun sirih akibat banyak bakteri Hyper-Ammonia Production (HAP) terbunuh sehingga degradasi protein pakan di dalam rumen menurun. Sebagaimana diungkapkan oleh Patra (2011) dan Russell & Houlihan (2003) bahwa penurunan konsentrasi NH3 dan aktivitas deaminase disebabkan oleh penurunan jumlah bakteri, khususnya bakteri HAP. Wallace et al. (2002) melaporkan bahwa bakteri yang paling sensitif terhadap minyak atsiri adalah spesies HAP, yaitu Prevotella spp. dan Ruminobacter amylophilus dimana bakteri HAP memiliki kemampuan yang tinggi menghasilkan NH3 dari protein pakan. Namun penurunan degradasi protein pakan oleh minyak atsiri dapat meningkatkan protein by-pass sehingga meningkatkan suplai protein total pada ternak (Lin et al. 2012). Dengan demikian, penggunaan minyak atsiri pada ternak ruminansia memiliki efek yang positif sepanjang tidak menurunkan produk fermentasi dalam jumlah yang besar.
3.1.4 Pengaruh Penambahan Tepung Daun Sirih Terhadap Kecernaan Bahan Kering (KCBK) dan Kecernaan Bahan Organik (KCBO) Data pengaruh penambahan tepung daun sirih terhadap KCBK dan KCBO dapat dilihat pada Tabel 3. Hasil analisis sidik ragam memperlihatkan bahwa tidak terdapat perbedaan yang nyata di antara perlakuan terhadap KCBK dan KCBO. Namun rataaan KCBK dan KCBO dengan penambahan tepung daun sirih dalam konsentrat lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol (0%). Level daun sirih 2% dari konsentrat lebih tinggi dari pada 4, 6, dan 8% dengan kata lain peningkatan level daun sirih dapat menurunkan KCBK dan KCBO.
Nilai KCBK dan KCBO cenderung lebih tinggi dengan level daun sirih yang rendah. Hasil penelitian Castillejos et al. (2006) melaporkan bahwa penggunaan Eugenol 50 mg/L dapat meningkatkan KCBK dan KCBO, nilai yang diperoleh adalah 53.90 dan 51.40% dibandingkan dengan kontrol (51.0 dan 49.3%). Patra dan Yu (2012) melaporkan bahwa penggunaan minyak atsiri tidak mempengaruhi kecernaan bahan kering dan neutral detergent fiber (NDF), tetapi penggunaan minyak atsiri dengan dosis yang tinggi dapat menurunkan kecernaan.
Tabel 4 Rataan Kecernaan in vitro dari Penambahan Tepung Daun Sirih dengan Level Berbeda dalam Konsentrat pada Fermentasi in vitro
Kecernaan in vitro
Level Tepung Daun Sirih
0% 2% 4% 6% 8%
KCBK (%) 48.65±2.12 53.21±6.07 51.54±3.95 52.67±2.05 50.78±1.44 KCBO (%) 46.79±2.76 51.79±5.73 50.38±4.63 51.10±2.03 49.79±1.77
16 Hal tersebut dapat disimpulkan bahwa penggunaan tepung daun sirih tidak memodifikasi fermentabilitas rumen. Namun pola yang terjadi pada kecernaan in vitro sama dengan hasil VFA, yang mana dengan penggunaan 2% cenderung lebih tinggi dengan perlakuan lainnya. Oleh sebab itu, penggunaan tepung daun sirih hanya dapat dan aman digunakan pada level 2%.
3.1.5 Pengaruh Penambahan Tepung Daun Sirih Terhadap Mikroorganisme Rumen dan Derajad Keasaman (pH)
Data pengaruh penambahan tepung daun sirih terhadap total bakteri, derajad keasaman (pH) dapat dilihat pada Tabel 4. Nilai pH rumen tidak dipengaruhi oleh penambahan tepung daun sirih pada percobaan in vitro. Pada fermentasi in vitro nilai rataan pH cairan rumen yaitu 6.7 pada setiap perlakuan sehingga nilai pH tersebut dapat mendukung kehidupan mikroorganisme dalam rumen. Hal tersebut didukung dengan hasil penelitian Lin et al. (2012) bahwa pH rumen tidak dipengaruhi oleh dosis dan jenis minyak atsiri.
Tabel 5 Rataan pH dan Total Bakteri Rumen dari Penambahan Tepung DaunSirih dengan Level Berbeda dalam Konsentrat pada Fermentasi in vitro
Parameter Level Tepung Daun Sirih
0% 2% 4% 6% 8%
pH 6.7 6.7 6.7 6.7 6.7
∑ Bakteri (cfu/mL) 7.5x106 1.2x107 6.4x106 2.8x106 3.8x106 ∑ Protozoa (cfu/ml) 2.3x105a 7.9x104b 8.3x104b 5.5x104b 4x104b a
Angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji selang berganda Duncan).
Asam yang diproduksi dalam fermentasi secara teori mampu menurunkan pH cairan rumen menjadi 2.5–3.0, namun pada kondisi normal pH dapat dipertahankan pada nilai 5.5–6.5 (McDonald et al. 1981). Nilai pH normal yaitu 5.5–6.5 (dengan pakan biji-bijian/konsentrat) dan 6–7 (pakan hijauan). Pitt et al. (1996) melaporkan bahwa pH rumen dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba, kecernaan dan konsentrasi VFA.
Total bakteri rumen dipengaruhi oleh penambahan tepung daun sirih pada setiap perlakuan. Namun secara statistik penambahan tepung daun sirih tidak berpengaruh nyata terhadap daya hidup bakteri. Penggunaan dalam jumlah yang besar dapat menurunkan total bakteri rumen. Jika digunakan pada level yang rendah (2%) berpengaruh baik terhadap pertumbuhan bakteri rumen dan lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol. Total bakteri rumen yang diperoleh pada perlakuan 2% yaitu 1,2 x 107 cfu/ml sedangkan pada perlakuan 0 % (kontrol) sebesar 7 x 106 cfu/ml dan pada perlakuan 4, 6, dan 8% masing-masing sebesar 6.4 x 106, 2.8 x106, dan 3.8 x106 cfu/ml (Tabel 4). Jumlah bakteri rumen yaitu 109–1010 per ml cairan rumen dan jumlah ini sangat dipengaruhi oleh jenis pakan
17 (McDonald et al. 1981) sedangkan menurut Koike dan Kobayashi (2009) jumlah bakeri rumen 1010–1011 per ml cairan rumen.
Patra dan Yu (2012) melaporkan bahwa penggunaan minyak atsiri dalam level yang rendah dan medium dapat meningkatkan populasi bakteri akan tetapi jika digunakan pada level yang tinggi cenderung akan menurunkan populasi bakteri. Acamovic dan Brooker (2005), melaporkan bahwa metabolit sekunder tanaman termasuk minyak atsiri dapat berinteraksi dengan berbagai macam komponen sel yang dapat memodulasi respon dari targetnya. Senyawa-senyawa tersebut memiliki kemampuan memodulasi sejumlah besar target seluler. Sebagian besar minyak atsiri menggunakan aktivitas antimikrobanya dengan berinteraksi dengan proses yang berkaitan dengan membran sel bakteri termasuk transport elektron, gradien ion, translokasi protein, fosforilasi, dan reaksi yang tergantung dengan jenis dan ketersedian enzim (Dorman dan Deans 2000). Selanjutnya, Benchaar et al. (2008) melaporkan bahwa penggunaan kandungan bahan aktif dari minyak atsiri dalam jumlah tertentu berdampak positif terhadap aktivitas mikroorganisme rumen.
Pengujian tepung daun sirih terhadap jumlah protozoa rumen disajikan pada Tabel 4. Hasil analisis keragaman memperlihatkan bahwa perlakuan memberikan pengaruh yang sangat berbeda nyata (P<0.01) terhadap jumlah protozoa. Peningkatan level daun sirih juga mampu menurunkan total protozoa. Pada perlakuan kontrol, jumlah protozoa sebesar 2.3x105 sedangkan perlakuan 2%, 4%, 6% dan 8% masing-masing 7.9x104, 8.3x104, 5.5x104, dan 5.4x104. Penurunan tersebut membuktikan bahwa tepung daun sirih mampu membunuh protozoa rumen dengan pemberian level tinggi. Namun dengan penggunaan level yang rendah cenderung meningkatkan jumlah protozoa.
Jumlah protozoa yang menghuni rumen lebih sedikit dari pada bakteri yiatu 106/ml (McDonald et al. 1981). Lebih lanjut McDonald et al. (1981) mengungkapkan bahwa ruminan tanpa protozoa dapat hidup normal, sehat, dan berdampak positif. Bahkan defaunasi (protozoa) menjadi objek kajian para ahli mikrobiologi (Wallace et al. 2002). Lin et al. (2012) melaporkan bahwa kombinasi minyak atsiri dapat menurunkan 50-90% protozoa dan fungi. Penurunan jumlah protozoa mampu mengurangi aktivitas deaminasi dan menurunkan amonia rumen dan degradasi protein pakan (Szumacher-Strabel et al. 2010). Dari hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa tepung daun sirih juga dapat dimanfaatkan sebagai agen defaunasi.
3.2 Kajian In Vivo Penambahan Tepung Daun Sirih Dalam Ransum Sapi