(Pangasionodon hypophthalmus)
ABSTRAK
Identifikasi gen penyandi hormon pertumbuhan pada ikan target merupakan langkah awal untuk pembuatan konstruksi all fish dan untuk membuat ikan transgenik. Penelitian dilakukan untuk mengidentifikasi dan mengkarakterisasi gen penyandi hormon pertumbuhan ikan patin siam (PhGH). Pelaksanaan penelitian dilakukan di Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik, Institut Pertanian Bogor. Identifikasi gen PhGH dilakukan melalui beberapa tahap yaitu ekstraksi RNA total, sintesis cDNA, amplifikasi PCR, isolasi fragmen DNA target, kloning dan pembacaan sekuens nukleotida. Analisis sekuens nukleotida menggunakan mesin ABIPRISM 3100 dan hasilnya dianalisis menggunakan program BLASTN/P dan GENETYX version 7. Sekuens nukleotida gen PhGH tersusun atas 1148 bp yang terdiri dari 603 bp daerah penyandian (ORF, open reading frame) dengan 200 asam amino residu, 18 bp daerah yang tidak dikodekan pada bagian ujung 5’, dan 527 bp pada ujung 3’. Gen PhGH memiliki beberapa ciri seperti halnya gen GH ikan umumnya yaitu: residu tryptophan (W) tunggal pada asam amino ke-104, 5 residu sistein (C) pada asam amino ke-71, 135, 173,190, dan 198, serta motif Asn-Xaa-Thr pada terminal C yang berpotensi sebagai lokasi N-linked glycosilation. Sinyal poliadenilasi (aataaa) berada pada 14 bp di bagian hulu lokasi poliadenilasi.
Kata kunci: identifikasi, karakterisasi, gen PhGH, Pangasionodon hypophthalmus
___________________________
*) Bab ini sebagian telah dipublikasi dengan judul: Identification of Growth Hormone Gene of Pangasionodon hypophthalmus, pada Indonesian Aquaculture Journal 2009; 4(1): 9-17
CHARACTERIZATION OF GENE ENCODING
GROWTH HORMONE ON STRIPPED CATFISH
(Pangasionodon hypophthalmus)
ABSTRACT
Identification of growth hormone (GH) gene on the target fish is the first step for the construction of "all fish gene transfer vector" and to generate transgenic fish. Research was done on the identification and characterization of stripped catfish (Pangasionodon hypophthalmus) GH gene (PhGH). This research was conducted at Reproduction and Genetic of Aquatic Organism Laboratory, Bogor Agricultural University. Steps of study performed to identify the PhGH gene were total RNA extraction, cDNA synthesis, PCR amplification, DNA fragment isolation, cloning and sequencing. Analysis of nucleotide sequence were done using ABIPRISM 3100, the results were then analyzed using BLASTN/P and GENETYX version 7 program. The full-length PhGH gene is 1148 bp in length, coding for an open reading frame (ORF) of 603 bp with 200 amino acid residues. The 5’ and 3’ untranslated regions of the PhGH gene are 18 bp and 527 bp, respectively. PhGH gene has some common characteristics that are owned by GH genes, such as single tryptophan residue (W) on the 104th amino acid, 5 cysteine residues (C) on the amino acid 71, 135, 173, 190 and 198 and a motif Asn-Xaa-Thr on C terminus which is the potential location for N-linked glycosilation. Polyadenylation signal (aataaa) was on the 14 bp at the upstream of polyadenylation location.
Keywords: identification, characterization, PhGH gene, Pangasionodon hypophthalmus
PENDAHULUAN
Hormon pertumbuhan adalah polipeptida yang sangat penting untuk pengaturan pertumbuhan pada vertebrata (Meier et al. 2006). Hormon pertumbuhan pituitari yang juga dikenal sebagai somatotropin pada ikan, merupakan protein kunci yang berperan dalam pengaturan pertumbuhan somatik dan banyak aspek metabolisme lainnya yang terdeteksi pada semua vertebrata (Ryynanen & Primmer 2006). Secara umum pada ikan, hormon pertumbuhan diproduksi di pituitari. Namun pada ikan salmon, hormon pertumbuhan selain diproduksi di pituitari, juga diproduksi di otot walaupun dalam jumlah yang relatif kecil (Devlin et al. 2009). Pada ikan, hormon pertumbuhan terlibat dalam sejumlah proses fisiologi termasuk keseimbangan ionik, metabolisme lipid dan
protein, pertumbuhan, reproduksi dan fungsi kekebalan, serta berbagai aspek tingkah laku (Perez-Sanchez 2000). Secara komersial hormon pertumbuhan diperlukan pada bidang obat-obatan, peternakan, akuakultur dan formulasi pakan hewan. Oleh sebab itu studi mengenai gen yang mengkodekan hormon tersebut dipelajari secara ekstensif pada beberapa spesies mamalia dan ikan (Anathy et al. 2001).
Dalam dua puluh tahun terakhir ini dikembangkan teknologi transfer gen yang ditujukan untuk mendapatkan produk perikanan dengan karakteristik yang diinginkan. Pada saat ini, transgen yang paling berhasil dan tampaknya yang pertama digunakan di ikan budidaya untuk konsumsi manusia adalah yang mengandung konstruksi gen penyandi hormon pertumbuhan (growth hormone, GH). Alasannya adalah bahwa konstruksi gen GH terbukti dapat meningkatkan pertumbuhan secara drastis pada berbagai spesies ikan seperti ikan mas (Cyprinus carpio) dan koki (Carrasius auratus gibelio) (Zhu 1992), channel catfish (Ictalurus punctatus) (Dunham et al. 1987), nila (Oreochromis niloticus) (Martinez et al. 1996), salmon Atlantik (Salmo salar) (Du et al. 1992), salmon coho (Oncorhynchus kisutch) (Devlin et al. 1994), rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) (Devlin et al. 2001), mud loach (Misgurnus mizolepis) (Nam et al. 2001) dan Arctic charr (Salvelinus alpinus) (Pitkanen et al. 1999).
Penelitian pengembangan teknologi transgenesis untuk memacu pertumbuhan ikan budidaya di Indonesia belum banyak dilakukan. Indonesia memiliki banyak jenis ikan yang sudah berhasil dibudidayakan. Di antara berbagai spesies ikan air tawar yang potensial untuk dibudidayakan secara komersial adalah ikan patin siam (Pangasionodon hypophthalmus). Untuk meningkatkan efisiensi budidaya ikan patin siam di Indonesia, perlu kiranya dikembangkan teknologi transgenesis untuk memproduksi induk unggul dengan karakter pertumbuhan yang cepat dalam rangka efisiensi pakan, tenaga dan biaya. Sebagai langkah awal untuk memproduksi ikan patin siam transgenik, maka penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengkloning dan mengkarakterisasi gen penyandi hormon pertumbuhan pada ikan patin siam (PhGH).
BAHAN DAN METODE
Isolasi RNA Total
RNA total diisolasi dari jaringan hipofisa, hati, otot, otak, limfa dan testes ikan patin siam yang masih hidup berukuran sekitar 500 gram. Jaringan diambil secara aseptis dan disimpan dalam botol sampel yang telah berisi isogen sebanyak 200 µl. Jaringan dihancurkan oleh penggerus yang sebelumnya telah disterilkan dengan DEPC 1%. Ke dalam Eppendorf ditambahkan larutan isogen sampai mencapai volume akhir 800 µl. Chloroform p.a. sebanyak 200 µl ditambahkan ke dalam Eppendorf dan larutan disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama lima menit pada suhu ruang. Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke dalam Eppendorf baru yang telah berisi 400 µl isopropanol. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C. Pada Eppendorf akan terbentuk pelet RNA, dan cairan yang terdapat pada Eppendorf dibuang. Ke dalam Eppendorf berisi pelet RNA ditambahkan 1 ml etanol 70% (dingin) kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit. Pelet RNA dikeringkan dengan cara membuang larutan yang terdapat pada Eppendorf. Sampel RNA disimpan dengan cara menambahkan 30 µl DEPC 1%. Konsentrasi RNA total hasil isolasi diukur menggunakan alat pengukur konsentrasi RNA/DNA (GeneQuant). Absorbansi diukur pada panjang gelombang 260 dan 280 nm.
Sintesis cDNA
Sintesis cDNA hormon pertumbuhan (cDNA GH) dilakukan menggunakan kit Ready-To-Go You-Prime First Strand Beads, FSRMB, (Amersham pharmacia biotech, USA). Konsentrasi RNA dibuat 3 μg dalam 30 μl DEPC. Larutan RNA diinkubasi pada suhu 65°C selama 10 menit dan kemudian disimpan di atas es (on ice). Sampel RNA dipindahkan ke dalam tube FSRMB dan ditambahkan 3 μl primer ’dT3’RACE-VECT” (5’-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAC GCG TGG TCG ACG GCC CGG GCT GGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT-3’) dengan konsentrasi 1 µg/3 µl. Larutan dihomogenkan dan
diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam. cDNA yang terbentuk ditambahkan 30 µl SDW steril dan disimpan dalam refrigerator.
Identifikasi Gen PhGH
Isolasi gen PhGH dilakukan dengan menggunakan cDNA yang disintesis dari RNA hasil ekstraksi dari kelenjar hipofisa, hati, otak, otot, limfa dan testes. Satu mikroliter cDNA digunakan sebagai cetakan untuk PCR, kemudian dicampur dengan 1 μl primer ghF (5’-TCA GAG AGA TTT GGC AAA ATG GCT-3’), 1 μl primer AP-1r (5’-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3’), 1 μl dNTP, 1 μl Ex Taq buffer, 0.05 μl Ex Taq polymerase (TAKARA) kemudian ditambahkan SDW sampai volume akhir menjadi 10 μl. PCR dilakukan dengan program: 94°C selama 3 menit; (94°C selama 30 detik; 59°C selama 30 detik; 72°C selama 1 menit) sebanyak 35 siklus; 72°C selama 3 menit; dan 4°C (tak hingga). Pengecekan hasil amplifikasi PCR dilakukan dengan elektroforesis menggunakan gel agarose 1%. Sebagai kontrol internal digunakan gen β-aktin. Deteksi gen β-aktin dilakukan dengan menggunakan metode PCR. Primer yang digunakan adalah F (5’-TAT GAA GGT TAT GCT CTG CCC-3’) dan bact-R (5’- CAT ACC CAG GAA AGA TGG CTG-3’). PCbact-R dilakukan dengan program: 94°C selama 3 menit; (94°C selama 30 detik; 58°C selama 30 detik; 72°C selama 30 detik) sebanyak 30 siklus; 72°C selama 3 menit; dan 4°C (tak hingga). Pengecekan hasil amplifikasi PCR dilakukan dengan elektroforesis menggunakan gel agarose 1%. Fragmen gen β-aktin ikan patin siam berada pada ukuran sekitar 300 bp.
Purifikasi Gen PhGH
Fragmen DNA hasil PCR diisolasi dari gel agarose menggunakan kit Mobio Ultra CleanTM 15 DNA Purification (MoBio Laboratories, CA, USA). Hasil PCR (40 μl) dielektoforesis dengan gel agarose 0,7%. Gel dipotong pada bagian yang terdapat band DNA, gel ditimbang dan dimasukkan ke dalam Eppendorf. TBE Gel Melt sebanyak ½ dari berat gel dan juga sodium iodida sebanyak 4,5 kali berat gel ditambahkan ke dalam Eppendorf. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 55°C selama 5 menit, sementara itu Glass Blind divorteks
selama 30 detik. Glass blind sebanyak 6 μl ditambahkan ke dalam Eppendorf, dibolak-balik beberapa kali dan diinkubasi kembali pada suhu ruang selama 5 menit. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 5 detik dengan suhu 4°C. Supernatan yang terbentuk dibuang, lalu ke dalam tabung ditambahkan 1 ml wash buffer dan etanol, kemudian divorteks sampai pelet hancur. Selanjutnya disentrifugasi selama 5 detik dengan kecepatan 13.000 rpm dan wash buffer dibuang sampai bersih. SDW sebanyak 9 μl ditambahkan dan diaduk sampai pelet hancur kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit pada suhu ruang, supernatan dipindahkan pada Eppendorf selanjutnya DNA dilarutkan dengan 12 μl SDW.
Ligasi Gen PhGH ke Vektor pGEM-T Easy
Fragmen DNA hasil purifikasi dari gel diligasi dengan vektor kloning pGEM-T Easy (Promega, WI, USA) dengan komponen reaksi ligasi meliputi 5 μl larutan DNA hasil purifikasi; 0,5 μl pGEM-T Easy; 6,5μl 5x buffer ligasi, dan 1μl enzim T4 DNA ligase (Promega). Inkubasi dilakukan selama dua jam pada suhu ruang dan dilanjutkan semalam di dalam refrigerator (suhu sekitar 4°C).
Transformasi ke Bakteri Escherichia coli DH5α
Pembuatan Bakteri Kompeten. Sebuah koloni bakteri E. coli DH5α
diambil dari biakan dan dikultur dalam 25 ml larutan LB. Proses inkubasi dilakukan pada suhu 37ºC selama 16-18 jam di dalam shaker. Subkultur dilakukan dengan mengambil 1% dari volume biakan dan dikultur kembali pada suhu 37ºC selama 3 jam di dalam shaker. Biakan disimpan di atas es selama 30 menit. Biakan sebanyak 1,5 ml dipindahkan ke dalam Eppendorf dan disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 5.000 rpm. Proses ini diulang sebanyak dua kali. Supernatan yang terbentuk dibuang. Endapan bakteri dicuci dengan menggunakan NaCl dingin kemudian disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Supernatan yang terbentuk dibuang. Endapan bakteri dicuci kembali menggunakan 1 ml CaCl2 dan dibiarkan selama 20 menit. Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 2 menit. Supernatan yang
terbentuk dibuang. Endapan bakteri disuspensi menggunakan 200 µl CaCl2 dan diinkubasi di atas es selama 20-60 menit.
Transformasi. Sebanyak 6,5 μl hasil reaksi ligasi dicampur ke dalam Eppendorf berisi sel kompeten E. coli DH5α. Transformasi dilakukan menggunakan kejutan panas pada suhu 42°C selama 45 detik. Sekitar 2-3 menit setelah diinkubasi dalam es. Ke dalam Eppendorf ditambahkan 900 μl larutan SOC (1,2 g polypeptone; 0,3 g yeast extract; 0,035 g NaCl; 0,011 g KCl; 600 μl MgCl2 1M; 600 μl MgSO4 1 M dan 60 μl glucose 2M dalam 60 ml SDW). Selanjutnya inkubasi dilakukan menggunakan shaker pada suhu 37°C selama 1 jam. Bakteri disebar di atas cawan agar 2xYT (1.6% polypeptone, 1% yeast extract, 0.5% NaCl dan 1.5% bacto agar dalam SDW) yang mengandung ampisilin, IPTG dan X-gal (disingkat menjadi 2xYT-A,I,X). Cawan agar berisi bakteri diinkubasi pada suhu 37°C selama sekitar 14 jam.
Identifikasi Transforman
Metode Cracking. Seleksi koloni bakteri yang membawa plasmid hasil ligasi dilakukan dengan metode “cracking”. Koloni bakteri berwarna putih yang tumbuh dalam cawan agarose diambil menggunakan tusuk gigi steril dan dioleskan ke dasar Eppendorf volume 1.5 ml untuk “cracking”, dan dilanjutkan dengan menggoreskan tusuk gigi tersebut ke dalam cawan agar 2xYT-A,I,X untuk membuat “master plate”. Master plate merupakan cawan agar yang mengandung setiap koloni bakteri yang dianalisa dengan cracking, yang merupakan sumber koloni bakteri untuk tahap penelitian berikutnya. Master plate diinkubasi pada suhu 37°C sekitar 8 jam. Ke dalam Eppendorf yang berisi bakteri ditambahkan 10 μl buffer cracking (0,2 g saccharosa, 40 μl NaOH 5 M, 50 μl SDS 10% dan sisanya SDW sehingga volume larutan menjadi 1 ml), 10 μl larutan EDTA 10 mM dan sekitar 2 μl 6x buffer loading DNA berisi KCl 4 M dengan perbandingan volume 1:1. Setelah diinkubasi sekitar 5 menit, dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 15 menit. Sebanyak 10 μl supernatan yang terbentuk digunakan untuk elektroforesis menggunakan gel agarose 0,7%. Untuk mengetahui koloni bakteri yang membawa DNA insersi dalam plasmid
digunakan koloni biru sebagai kontrol. Ukuran DNA plasmid koloni bakteri yang membawa insersi akan lebih besar daripada yang dari kontrol. Koloni bakteri yang membawa DNA insersi diambil dari master plate menggunakan tusuk gigi steril dan disentuhkan ke media cair 2xYT yang mengandung ampisilin dalam tabung kultur berbentuk “L” untuk diperbanyak. Inkubasi bakteri menggunakan shaker dilakukan pada suhu 37°C selama sekitar 14 jam.
Metode PCR. Untuk mengetahui keberhasilan transformasi, maka dilakukan isolasi plasmid pada koloni bakteri yang positif membawa gen insersi. Proses PCR dilakukan dengan menggunakan primer ghF dan primer ghR.
Pembacaan Sekuens Nukleotida Gen PhGH
Isolasi Plasmid. Plasmid pGEM-T Easy yang mengandung gen PhGH diisolasi dari bakteri E. coli. Satu koloni bakteri yang mengandung plasmid rekombinan ditumbuhkan di dalam 2 ml media Luria Bertani (LB) (10 g/l polypeptone, 5 g/l yeast extract, 10 g/l NaCl, pH 7,5) yang mengandung ampisilin 100 mg/l pada shaker dengan kecepatan 250 rpm, suhu 37ºC selama semalam. Bakteri diendapkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm, suhu 4ºC, selama 10 menit. Pelet yang terbentuk digunakan sebagai sampel untuk isolasi plasmid dengan menggunakan kit GF-1 Plasmid DNA Extraction (Vivantis) sesuai dengan prosedur pada manualnya.
Pelet diresuspensi dengan 250 µl buffer resuspensi (larutan S1) kemudian divorteks dan ditambahkan 250 µl buffer lisis (larutan S2) sampai tercampur. Ke dalam larutan ditambahkan 250 µl buffer netralisasi (buffer NB), kemudian Eppendorf dibolak balik. Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 10.000 rpm, suhu 4ºC, selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke spin colomn kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit. Spin colomn dicuci menggunakan 700 µl wash buffer kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit dan hasil sentrifugasi dibuang. Colomn dikeringkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit. Colomn dipindahkan ke Eppendorf baru dan disuspensi dengan 50 µl elution buffer atau SDW kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit. Eppendorf yang
berisi colomn disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit untuk melarutkan DNA dan selanjutnya disimpan pada suhu -20ºC.
Pembacaan Sekuens Nukleotida. Pembacaan sekuens cDNA dilakukan terhadap klon-klon cDNA GH terpilih yang didasarkan pada ”dideoxy-nucleotide chain-termination” menggunakan mesin otomatis ABI PRISM 3100. Konsentrasi DNA diukur dengan menggunakan genequant. PCR untuk sekuensing menggunakan primer target dan reagen khusus untuk sekuens yaitu big dye. Volume PCR 10 µl terdiri dari 1µl ready reaction premix (2,5x), 1 µl big dye sequence buffer (5x), 3,2 µl primer (10 pmol), 0,5 µl plasmid (300 ng), dan 4,3 µl SDW.
Analisis Sekuens Gen PhGH
Sekuens nukleotida dianalisis dengan menggunakan program Genetyx 7 dan BLASTN/P. Analisis dengan menggunakan program Genetyx 7 akan menghasilkan deduksi asam amino, pensejajaran nukleotida hormon pertumbuhan beberapa spesies ikan, dan filogenetik gen hormon pertumbuhan pada beberapa ordo spesies ikan. Analisis dengan menggunakan program Blast P akan menghasilkan indeks similaritas antar sekuens asam amino pada beberapa spesies ikan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Identifikasi Gen PhGH
Identifikasi gen PhGH dilakukan pada beberapa jaringan tubuh ikan antara lain hipofisa, hati, otot, otak, limfa, dan testes (Gambar 3). Berdasarkan hasil elektroforesis, gen PhGH hanya teridentifikasi pada jaringan hipofisa. Pita DNA dengan panjang sekitar 1200 bp merupakan kandidat fragmen gen PhGH. Sebagai kontrol internal digunakan gen β-aktin ikan patin siam. Fragmen gen β -aktin ikan patin siam berada pada ukuran sekitar 300 bp.
Gen PhGH diisolasi dan dipurifikasi untuk kemudian diligasi dengan vektor pGEM-T Easy. Proses kloning dilakukan dengan cara mentransformasi vektor pGEM-T Easy ke dalam bakteri E. coli DH5α dan kemudian dikultur
dalam media agar. Keberhasilan proses kloning dideteksi dengan menggunakan metode cracking. Hasil cracking dapat dilihat pada Gambar 4. Plasmid yang mengandung gen PhGH berada pada ukuran yang lebih besar dibandingkan dengan kontrol (blue colony, B) yaitu plasmid yang tidak terinsersi gen PhGH. Berdasarkan hasil tersebut, maka dipilih klon nomor 3 dan 5 untuk selanjutnya dilakukan proses sekuensing.
Gambar 3 Deteksi gen penyandi hormon pertumbuhan pada beberapa jaringan tubuh ikan patin siam (A). Produk PCR dari beberapa jaringan menggunakan primer gen β-aktin dengan panjang fragmen sekitar 300 bp (B). M adalah marker DNA 0.1-10.0 kb (BioLabs Inc., New England).
Pembacaan sekuens nukleotida gen PhGH pada klon 3 dan 5 dilakukan dari arah forward dan reverse. Alignment dilakukan untuk mendapatkan urutan nukleotida yang sama. Sekuens nukleotida dan deduksi asam amino gen PhGH dapat dilihat pada Gambar 5.
Hasil pembacaan sekuens nukleotida gen PhGH menunjukkan bahwa sekuens gen PhGH berukuran 1148 bp yang terdiri atas 18 bp pada daerah yang tidak diterjemahkan (UTR) pada ujung 5’ dan 527 bp pada ujung 3’ serta daerah penyandian (ORF) sepanjang 603 bp (Gambar 5). Translasi asam amino diawali
0,5 kb - 1 kb - 0,5 kb - 3 kb -
M hipofisa hati otot otak limfa testes
(A)
(B)
1200 bp
dengan sekuens ATG atau dikenal dengan kodon awal yang disandikan dalam bentuk methionin (M). Sedangkan kodon akhir ditandai dengan sekuens TAG yang walaupun tidak diterjemahkan ke dalam bentuk asam amino tetapi merupakan sekuens sinyal berakhirnya aktivitas translasi.
B 1 2 3 4 5 B 6 7 8 9 10 B 11 12 13 14 B
Gambar 4. Cracking hasil transformasi pada plasmid pGEM-T Easy yang diligasi gen PhGH. B = blue colony (kontrol). Angka di atas gambar menunjukkan nomor klon bakteri.
Gen GH antar spesies ikan memiliki ukuran yang bervariasi. Gen GH pada Pangasionodon gigas berukuran 1176 bp (no aksesi L27835.1; Lemaire et al. 1994), Cyprinus carpio berukuran 1164 bp (no aksesi M27000; Koren et al. 1989), Oncorhynchus keta berukuran 1120 bp (no aksesi K03050; Sekine et al. 1985), Oncorhynchus mykiss berukuran 1161 bp (no aksesi M24683; Rentier-Delrue et al. 1989a) dan Oreochromis niloticus berukuran 847 bp (no aksesi M26816; Rentier-Delrue et al. 1989b).
Gen PhGH memiliki beberapa ciri khas yang umum dimiliki oleh gen GH antara lain: memiliki residu tryptophan (W) tunggal yaitu pada asam amino ke-104, memiliki 5 residu sistein (C) yaitu pada asam amino ke-71, 135, 173, 190 dan 198 dan memiliki motif Asn-Xaa-Thr pada C terminus yang merupakan lokasi potensial untuk N-linked glycosilation. Sinyal poliadenilasi (aataaa) berada pada 14 bp di bagian hulu lokasi poliadenilasi.
tcagagagatttggcaaaatggctagagtgttggtggtgctctctgtggtggtggc 60 M A R V L V V L S V V V A g a g t t t g t t c t t t a g t c a a g g c g c g a c a t t c g a g a a c c a g c g g c t c t t c a a c a a c g c a g t 1 2 0 S L F F S Q G A T F E N Q R L F N N A V c a t c c g t g t g c a a c a c c t t c a t c a g c t g g c t g c c a a g a t g a t g g a t g a c t t t g a g g a a g c 1 8 0 I R V Q H L H Q L A A K M M D D F E E A t c t g t t a c c t g a a g a a c g c a a a c a g c t g a g c a a g a t t t t c c c c c t g t c t t t c t g c a a c t c 2 4 0 L L P E E R K Q L S K I F P L S F C N S g g a c t c c a t c g a a g c t c c t g c a g g c a a g g a c g a g a c c c a g a a a a g c t c t g t g c t g a a a t t 3 0 0 D S I E A P A G K D E T Q K S S V L K L g c t g c a c a c c t c c t a c c g t c t g a t c g a g t c a t g g g a g t t c c c c a g c a a g a a c c t c g g c a a 3 6 0 L H T S Y R L I E S W E F P S K N L G N c c c c a a c c a c a t c t c a g a g a a g c t g g c t g a c c t g a a a a t g g g c a t c g g c g t g c t t a t c g a 4 2 0 P N H I S E K L A D L K M G I G V L I E g g g a t g t t t g g a t g g a c a a a c c a g c c t g g a t g a g a a c g a c t c t c t g g c t c c g c c c t t c g a 4 8 0 G C L D G Q T S L D E N D S L A P P F E g g a t t t c t a c c a g a c c t t g a g c g a g g g a a a c c t g a g g a a g a g c t t c c g t c t g c t g t c c t g 5 4 0 D F Y Q T L S E G N L R K S F R L L S C c t t c a a g a a g g a c a t g c a c a a a g t g g a g a c c t a t c t c a g c g t g g c c a a g t g c a g g a g a t c 6 0 0 F K K D M H K V E T Y L S V A K C R R S c c t g g a t t c c a a c t g c a c c c t g t a g g g g g c g a g a g a g c a c a a t t t a g c c a c a g c c t g t g a 6 6 0 L D S N C T L * t c t c a g a c a g a t t t t g t a t t t a a a t t a a a a a a a a a a c t c t g t c c a g g c c t g g c t a a a t g t 7 2 0 a t c a g c c t c t t t c t c t g g t t t c a c t t c t g a c t t t a t g t a t t t a t t c t g c t c a c c g a g g a g 7 8 0 a a c t c c t c c a t t c a c a t t t t t a g c a g a t t t c t c t g t c c c g g c a a c t t a a a g g t t g t a a a a 8 4 0 t g g g a c c a a t t t c a c a a t g g t g c t a t g c a a a t t c a g c t t t a t a t c a a a t a a t g a c c a g a a 9 0 0 a a a t g a c t a g g t c t a t t t c t t t t a a c t t a t t g g c t a c a a a t t g g a t a a t c t g a t t t a a c a 9 6 0 a t c g t g t t a a c t t t g g a a t g g a c g a g t t c g c t c c t g g c c a g t g a a t g t t a a a t a t t c a a a 1 0 2 0 g t g t a t a t t t t c a t a t c a a a g t c t a t a c t t a t t g t t c a g c a t t g a c t a t t t c t g t g t g t a 1 0 8 0 a a t c t g t c a t t g t t g t t g t g g a t t t c ca a t a a a g c t a a t t c t t g c a t t a a a a a a a a a a a a 1 1 4 0 a a a a a a a a a a a a
Gambar 5. Sekuens nukleotida dan deduksi asam amino penyusun gen PhGH. Lokasi N-glikosilasi ditandai dengan huruf yang digaris bawah. Sinyal poliadenilasi (aataaa) dan poliadenilasi ditandai dengan huruf miring yang digarisbawahi.
Homologi Sekuens Asam Amino Gen PhGH
Analisa BlastP antara sekuens asam amino gen PhGH dengan beberapa spesies ikan dari lima ordo yang berbeda ditunjukkan pada Gambar 6. Sekuens asam amino penyusun gen GH jumlahnya berbeda antar ordo yang berbeda. Sekuens asam amino penyusun gen GH ordo siluriformes berjumlah 200 asam amino, ordo cypriniformes berjumlah 210 asam amino, ordo salmoniformes berjumlah 210 asam amino, ordo perciformes berjumlah 204 asam amino, sedangkan ordo anguilliformes berjumlah 209 asam amino.
Gambar 6. Perbandingan sekuens asam amino gen PhGH dengan spesies-spesies ikan dari lima ordo yang berbeda. P. hypophthalmus (no aksesi ACW 82446; Sekar et al. 2009), Clarias gariepinus (no aksesi ACN 97175; Wang et al. 2009), Clarias batrachus (no aksesi AAL 84164; Das et al. 2001), Ctenopharyngodon idella (no aksesi AAA 58724; Ho et al. 1989), Cyprinus carpio (no aksesi AAA 49208; Koren et al. 1989), Oncorhynchus mykiss (no aksesi AAA 49556; Agellon et al. 1988), Oncorhynchus keta (no aksesi AAA 49406; Shen et al. 1993), Oreochromis niloticus (no aksesi AAA 49626; Ber & Daniel 1992), Oreochromis mossambicus (no aksesi AAC 77876; Chen et al. 1997), Anguilla japonica (no aksesi AAA 48535; Saito et al. 1988), Anguilla Anguilla (no aksesi AAN 61122; Goldberg et al. 2002).
Hasil penelitian Ryynanen & Primmer (2006) menunjukkan adanya dugaan daerah sinyal peptida yang diprediksikan pada 22 asam amino pertama di seluruh pre-GH teleost yang diteliti (salmoniformes, siluriformes dan cypriniformes) dengan kekecualian pada perciformes, dimana sinyal peptida terdiri dari 17 atau 18 residu asam amino pertama pada pre-GH. Pada ordo siluriformes, deduksi asam amino gen GH mengandung 200 asam amino yang terdiri dari 178 “mature peptide” dan 22 asam amino sinyal peptida. Secara umum pada ikan termasuk silurids, terdapat dua dugaan lokasi N-glikosilasi (Asn-Xaa-Thr atau Ser) yang secara normal berada pada asam amino ke-125 dan 175 pada “mature peptide” (Anathy et al. 2001). Domain N-glikosilasi mengandung empat asam amino yaitu asparagin, sistein, treonin dan leusin. N-glikosilasi terlibat di dalam regulasi aktivitas transport dan ekspresi permukaan dari transporter neurotransmitter (Bennet & Kanner 1997).
Pensejajaran sekuens asam amino gen penyandi hormon pertumbuhan ikan patin siam yang berasal dari sampel dan yang ada di bank gen menunjukkan adanya kemiripan 100%. Adapun pensejajaran sekuens asam amino dari lima ordo spesies ikan yang berbeda menunjukkan bahwa spesies-spesies ikan dari ordo siluriformes dan cypriniformes memiliki lima residu sistein sedangkan pada ordo anguilliformes, salmoniformes dan perciformes memiliki empat residu sistein. Residu sistein berada pada posisi yang conserved. Menurut Anathy et al. (2001), daerah C-terminal memiliki kemiripan yang tinggi diantara seluruh ikan teleost yang mengandung 3 dari 4 residu sistein yang diketahui penting untuk pembentukan ikatan disulfida. Sistein pertama berada pada posisi yang conserved yaitu pada asam amino ke-71 (70 pada perciformes). Residu sistein bertanggung jawab untuk ikatan disulfida pada seluruh anggota famili GH/PRL. Keberadaan ikatan ini penting untuk integritas struktural dan aktivitas biologi hormon. Dugaan secara fungsional lokasi yang penting dari GH juga relatif conserved ketika sekuens GH teleost dibandingkan dengan sekuens GH mamalia lainnya (Liu et al. 2001 dalam Ryynanen & Primmer 2006). Lebih dari 30% lokasi asam amino yang dilaporkan pada mamalia identik dengan asam amino ikan dan 54% lokasi asam amino pada teleost sama dengan paling sedikit satu spesies mamalia.