TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Karakteristik Domba Ekor Tipis
Domba merupakan hewan ruminansia kecil yang dipelihara sebagai hewan gembala di dataran rendah. Domba dipelihara untuk dimanfaatkan wol dan dagingnya (Hafez dan Hafez 2000). Oleh karena peralatan domba tidak terlalu mahal, persyaratan kandang sederhana, dan persyaratan pakan tidak sulit maka domba dapat dimanfaatkan sebagai hewan percobaan di laboratorium. Domba seperti halnya kambing, kerbau, dan sapi, tergolong dalam famili Bovidae. Klasifikasi domba berdasarkan taksonomi adalah sebagai berikut (Herren 2000).
Kingdom : Animalia Filum : Chordata Kelas : Mammalia Ordo : Artiodactyla Famili : Bovidae Subfamili : Caprinae Genus : Ovis Spesies : Ovis aries
Kelompok domba yang digunakan sebagai hewan coba dalam penelitian untuk penulisan Skripsi ini adalah kelompok Domba Ekor Tipis. Domba Ekor Tipis banyak ditemukan di daerah-daerah dengan curah hujan yang cukup tinggi seperti di Jawa Barat (Doho 1994).
Domba Ekor Tipis memiliki ciri morfologi berekor tipis dan pendek, memiliki warna dominan putih dan ada belang hitam di sekeliling mata, hidung, dan dapat pula diseluruh tubuhnya, tidak ada deposisi lemak dibagian ekor, domba jantan memiliki tanduk yang melengkung sedangkan domba betina pada umumnya tidak bertanduk. Domba Ekor Tipis memiliki ukuran telinga yang sedang dan wol yang kasar (Iniquez et al. 1993). Domba ini memiliki bobot badan domba betina dewasa bervariasi dari 25 sampai dengan 35 kg dengan tinggi badan rata-rata 57 cm, sedangkan bobot badan domba jantan dewasa berkisar antara 40 sampai dengan 60 kg dengan tinggi badan rata-rata 60 cm. Rataan bobot lahir dan
bobot sapih Domba Ekor Tipis yang dipelihara dengan sistem penggembalaan masing-masing 2,2 dan 10 kg/ekor. Karakteristik Domba Ekor Tipis dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Karakteristik Domba Ekor Tipis
Karakteristik Keterangan
Keturunan asal Java thin tailed sheep breed. Penyebaran di Indonesia Seluruh Pulau Jawa.
Kemampuan adaptasi terhadap lingkungan
Sangat baik beradaptasi pada
lingkungan tropis dan kondisi pakan yang buruk.
Reproduksi khusus Mudah berkembang biak dan
perawakan kecil, tidak dipengaruhi oleh musim kawin, dapat
menghasilkan tiga anak dalam dua tahun.
Warna bulu Pada umumnya putih, kadang ada
sedikit bercak hitam pada bagian mata dan hidung.
Tanduk Hanya dimiliki oleh domba jantan,
berbentuk melingkar dengan ukuran kecil.
Rata-rata umur untuk dikawinkan 12 bulan untuk domba jantan dan 10 bulan untuk domba betina.
Rata-rata umur pubertas 10 bulan untuk domba jantan dan 8 bulan untuk domba betina.
Berat lahir 1,5 kg untuk domba jantan dan 1,3
untuk domba betina.
Sumber: Bamualim (2008)
2.2. Reproduksi dan Superovulasi Domba
Kemampuan reproduksi domba dapat dipengaruhi oleh faktor genetik (bangsa domba) dan beberapa faktor lain seperti jenis kelamin, cuaca dan iklim, dan pakan yang diberikan. Domba-domba betina mencapai masa pubertas pada umur 5 sampai dengan 7 bulan dan dapat dikawinkan untuk pertama kali pada umur 8 bulan atau lebih. Siklus berahi pada domba rata-rata terjadi setiap 16 hari sekali (dengan kisaran antara 14 sampai dengan 20 hari), dengan lama estrus rata- rata 30 jam. Ovulasi terjadi sekitar 24 sampai dengan 30 jam setelah awal estrus. Oleh karena itu, kebuntingan sangat mungkin terjadi apabila perkawinan terjadi pada saat akhir masa berahi.
Domba Ekor Tipis mempunyai keunggulan selain mudah beradaptasi dengan lingkungan, juga memiliki sifat prolifik yaitu kemampuan beranak hingga 4 ekor dalam satu kelahiran (Inonuo dan Iniguez 1991). Kenyataan di lapangan menunjukan semua jenis domba yang beranak lebih dari dua ekor, akan diikuti dengan angka kematian yang tinggi, sehingga pada akhirnya mengakibatkan rendahnya efisiensi reproduksi. Kemungkinan penyebabnya adalah telah terjadi persaingan antaranak dalam pengambilan zat makanan sejak awal kebuntingan, sementara induk tidak mempunyai persiapan yang memadai.
Efisiensi reproduksi ternak domba sangat bergantung pada keberhasilan proses reproduksi. Salah satu cara meningkatkan potensi reproduksi domba adalah melalui superovulasi. Superovulasi berasal dari kata super berarti luar biasa dan ovulasi berati pelepasan sel telur atau ovum dari folikel de Graaf. Secara umum superovulasi merupakan suatu upaya memanipulasi folikulogenesis sehingga jumlah ovulasi meningkat dibanding normal. Peningkatan jumlah folikel yang berkembang hingga mengalami ovulasi dirangsang melalui penyuntikan pregnant mare serum gonadotrophin/human chorionic gonadotrophin (PMSG/hCG). Dengan meningkatnya jumlah folikel yang dihasilkan maka jumlah sel telur yang diovulasikan dan yang dibuahi akan menjadi bertambah sehingga jumlah anak per kelahiran dapat meningkat. Keberhasilan penggunaan PMSG/hCG dalam meningkatkan jumlah folikel dan korpus luteum dapat dilihat dari meningkatnya sekresi hormon-hormon kebuntingan, pertumbuhan uterus, embrio, dan fetus, peningkatan bobot lahir dan bobot sapih, pertumbuhan dan perkembangan kelenjar susu, dan produksi susu pada domba (Manalu et al. 1998; Manalu et al. 1999; Manalu et al. 2000a; Manalu et al. 2000b).
2.3. Sinkronisasi Berahi
Sinkronisasi berahi merupakan upaya untuk meningkatkan jumlah hewan yang berahi pada waktu yang bersamaan. Hormon luteolitik yang umum digunakan untuk sinkronisasi berahi adalah prostaglandin F2α (PGF2α) (Sumaryadi 2003). Dasar fisiologis dari sinkronisasi berahi adalah hambatan pelepasan follicle stimulating hormone (FSH) dari hipofisa anterior sehingga
menghambat pematangan folikel de Graaf atau penyingkiran corpus luteum (CL) baik secara manual maupun secara fisiologis.
Prostaglandin F2α (PGF2α) merupakan preparat hormon luteolitik yang berfungsi menginduksi kejadian berahi melalui penyingkiran CL. Proses pertumbuhan dan perkembangan folikel ovari sangat bergantung pada kehadiran FSH dan luteinizing hormone (LH). Kedua hormon tersebut sangat esensial dalam sintesa estrogen. Jika hanya terdapat LH secara tunggal, maka tidak akan berpengaruh terhadap pertumbuhan dan perkembangan folikel.
2.4. Hormon Reproduksi
Fluktuasi berbagai hormon reproduksi pada domba betina dewasa disebut sebagai siklus berahi yang terdiri atas proestrus, estrus, metestrus, dan diestrus. Siklus berahi juga dikenal sebagai fase folikel yang terdiri atas fase pertumbuhan folikel yang ditandai dengan level estrogen tinggi dan fase luteal yang memiliki waktu cukup panjang yang ditandai dengan perkembangan CL dan kadar progesteron tinggi.
Hipothalamus, hipofisa, gonad dan plasenta merupakan kelenjar endokrin reproduksi yang akan bekerja sama membuat suatu putaran interkoneksi, yang dikenal sebagai poros Hipothalamus-hipofisagonadal (Iman dan Fahriyan 1992). Pada hipothalamus bagian median eminentia dan preoptik, Gonadotropin Releasing Factor (GnRH) diproduksi oleh sel-sel neuron endokrin setelah mendapat rangsangan dari sistem saraf pusat (SSP), GnRH ditransportasikan melalui Hypothalamus-hypophyseal portal system menuju kelenjar hipofisa anterior.
Pelepasan GnRH dari terminal saraf dan median eminence ke dalam hipophyseal portal darah merupakan sinyal neuroendokrin untuk terjadinya proses ovulasi. Gonadotropin Releasing Factor (GnRH) akan menstimulasikan sel-sel gonadotrof kelenjar hipofisa untuk mensekresikan FSH dan LH. Gonadotropin Releasing Factor (GnRH), FSH dan LH akan dilepaskan dengan lonjakan- lonjakan tertentu. Follicle stimulating hormone (FSH) dan LH akan bekerja pada sel target dari gonad (Iman dan Fahriyan 1992).
Sekresi FSH terjadi secara ritmis selama 4 sampai dengan 5 hari sebelum berahi, menjelang fase luteal berakhir konsentrasi FSH dalam plasma meningkat dan secara sinergis dengan LH, akan merangsang pertumbuhan folikel. Folikel akan mencapai stadium folikel tersier yang matang. Dalam waktu yang cukup singkat dibawah pengaruh FSH dan estradiol 17ß terjadi pembentukan reseptor- reseptor untuk kedua macam hormon tersebut, sedangkan pada sel-sel granula juga terjadi induksi pembentukan reseptor untuk LH.
Follicle stimulating hormone (FSH) akan menstimulasikan sel-sel granulosa untuk memfasilitasi proses oogenesis dan bertanggung jawab atas perkembangan dan pematangan folikel, LH berfungsi menstimulasikan sintesa androstenedion dari kolesterol, dan selanjutnya dikonversi ke dalam testosteron. Pada sel-sel granulosa terjadi aromatisasi estradiol-17ß dibawah pengaruh FSH membentuk estrogen (Iman dan Fahriyan 1992).
Hormon ataupun target organ memiliki suatu sistem homeostatik feedback, yaitu semua mekanisme hormon diatur oleh sekresi hormon itu sendiri. Folikel ovari matang dan kadar estrogen di atas ambang akan berespons terhadap hipothalamus untuk menekan pelepasan FSH dan selanjutnya memfasilitasi pelepasan LH untuk menandai proses ovulasi. Pada saat tersebut sel-sel granulosa memproduksi inhibin yang bekerja khusus untuk menghambat produksi FSH (feedback negatif).
Estrogen dapat menyebabkan feedback positif terhadap Hipothalamus dan hipofisa anterior, yakni kadar estrogen meningkat akan menyebabkan peningkatan sekresi GnRH, demikian pula akan terjadi peningkatan kadar gonadotropin dari hipofisa anterior. Tingginya kadar estrogen merupakan sinyal untuk pelepasan LH dalam kaitannya dengan persiapan ovulasi.
Superovulasi dapat dilakukan melalui beberapa cara yang berbeda, diantaranya dalam pemberian dosis, preparat hormon dan prosedur pelaksanaan (Iman dan Fahriyan 1992). Pemakaian gonadotropin seperti PMSG/hCG seringkali dilakukan pada superovulasi. Pregnant mare serum gonadotrophine/human chorionic gonadotrophin (PMSG/hCG) merupakan hormon ganadotropin yang dihasilkan oleh plasenta dengan aktivitas biologik menyerupai FSH dan LH sehingga disebut sebagai gonadotrophin sempurna.
Pengaruh yang ditumbulkan oleh PMSG antara lain merangsang pertumbuhan folikel, menunjang produksi estrogen, ovulasi, luteinisasi, dan merangsang sintesis progesteron pada domba yang dihipofisektomi. Waktu paruh biologis PMSG adalah panjang 40 sampai dengan 125 jam (Hafez dan Hafez 2000). Pregnant mare serum gonadotrophine (PMSG) sebagai glikoprotein yang terdiri atas subunit α dan ß dengan kadar karbohidrat tinggi, yakni kadar asam sialat yang dapat mengakibatkan waktu paruh PMSG cukup panjang dibandingkan dengan gonadotropin lainnya (Hafez dan Hafez 2000). Pregnant mare serum gonadotrophine (PMSG) dengan dosis tunggal melalui intramuskuler cukup untuk menimbulkan ovulasi berganda. Penggunaan PMSG menimbulkan respons yang sangat variatif mulai dari tidak berespons, kadang-kadang sampai berespons berlebihan. Apabila pemberian PMSG tidak disertai dengan pemberian hormon lain, PMSG harus diberikan pada awal fase luteal, yaitu hari ke-16 siklus uterus untuk domba.
Keberhasilan cara superovulasi, ternyata membawa pengaruh yang besar terhadap stimulasi uterus, yang diawali dari laju ovulasi, peningkatan jumlah korpus luteum berlanjut terhadap sekresi beberapa hormon dan faktor tumbuh yang disekresikan oleh korpus luteum. Perjalanan panjang ini akan mempengaruhi ekspresi gen dalam pertumbuhan sel-sel stroma uterus yang dimanifestasikan terhadap bobot fetus domba yang di superovulasi lebih berat dari yang tidak di superovulasi (Sumaryadi et al. 2002).
2.5. Hematologi Domba
Darah adalah cairan tubuh yang terdapat di luar sel dan terdapat pada semua hewan kelas tinggi yang berfungsi mengirimkan nutrisi dan oksigen yang dibutuhkan oleh jaringan tubuh dan membunuh kuman penyakit (bakteri atau virus) yang masuk ke dalam tubuh, serta mengangkut bahan-bahan kimia hasil metabolisme. Darah dialirkan ke seluruh tubuh melalui pembuluh darah yang ada diseluruh tubuh. Komponen darah terdiri atas bagian cair dan bagian padat. Bagian cair merupakan bagian dari 55% darah yang disebut dengan plasma. Plasma darah mengandung 91 sampai dengan 93% air yang berfungsi sebagai pelarut, pembawa sel-sel darah dan komponen didalamnya, serta sebagai pengatur
panas tubuh, elektrolit (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, HCO3-, HPO42-, H2PO4-, H+) yang berfungsi sebagai sistem penyangga (buffering), dan gas terlarut, yakni O2 dan CO2. Darah mengandung 5 sampai dengan 7% protein plasma, yakni albumin, globulin, fibrinogen, dan plaminogen. Albumin adalah protein plasma yang lebih kecil sehingga lebih cepat bergerak dan larut dalam air serta memiliki satu fraksi. Albumin merupakan 60% total plasma protein yang berfungsi untuk mempertahankan tekanan osmotik plasma. Globulin adalah protein plasma yang larut dalam air garam dan memiliki tiga fraksi, yaitu 2α, 2 , dan 1 . Bagian padat merupakan bagian dari 45% darah yang terdiri atas sel darah merah (eritrosit), sel darah putih (leukosit), dan keping darah (trombosit). Bagian darah yang mempunyai fungsi penting dalam proses pembekuan darah adalah trombosit (Poedjiadi 2006).
2. 6. Sel Darah Merah
Sel darah merah (eritrosit) dibuat dalam sumsum tulang secara mitosis dan diferensiasi dengan membawa hemoglobin. Komposisi sel darah merah adalah 62 sampai dengan 72% air, 35% padatan yang terdiri atas 95% hemoglobin dan 5% lagi berupa protein distroma dan membran sel, fosfolipid (lecithine, cephaline), kolesterol, lemak, vitamin, koenzim, glukosa, enzim, dan mineral. Eritrosit pada domba berbentuk cakram (disk) bikonkaf, dengan pinggiran sirkuler. Bentuk sel dapat berubah ketika sel melewati pembuluh kapiler tetapi sel darah merah memiliki membran sel yang kuat sehingga tidak akan pecah. Sel darah merah dapat bertahan selama 120 hari sampai dengan 125 hari dalam sirkulasi dan kemudian mengalami kerusakan. Sekitar 0,8% dari seluruh eritrosit mengalami kerusakan dan dibentuk setiap hari. Penghancuran sel-sel darah merah terjadi setelah mengalami sirkulasi tiga sampai empat bulan. Sel darah merah pada domba dapat dilihat pada Gambar 1.
Sumber: Anonim (2008)
Gambar 1 Sel darah merah domba
Sel-sel darah merah mengalami disintegrasi, melepaskan hemoglobin ke dalam darah, dan debris (puing-puing) sel yang rusak itu dibuang dari sirkulasi oleh sistem makrofag atau sistem retikuloendotelial, yang terdiri atas sel-sel khusus di dalam hati, limfa, sumsum tulang, dan limfonodus (Frandson 1996).
2. 7. Hematokrit
Nilai hematokrit adalah persentase berdasarkan volume dari darah, yang terdiri dari sel-sel darah merah. Penentuannya dilakukan dengan mengisi tabung hematokrit dengan darah yang diberi zat agar tidak menggumpal, kemudian dilakukan sentrifuse sampai sel-sel mengumpul di dasar (Frandson 1996). Hematokrit disebut juga dengan Packed Cell Volume (PCV). Hematokrit merupakan perbandingan antara volume sel darah merah dan komponen darah yang lain. Volume sel darah merah berbanding lurus terhadap jumlah sel darah merah dan kadar hemoglobin.
Jumlah sel darah merah dipengaruhi oleh faktor spesies, umur, jenis kelamin, nutrisi, keadaan fisiologis seperti laktasi, kebuntingan, dan siklus berahi, suhu, daerah dataran tinggi, dan keadaan patologis. Parameter pemeriksaan sel darah merah domba normal dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Parameter pemeriksaan sel darah merah domba normal
Parameter Kisaran (Rata-rata) Satuan
Sel Darah merah 8–16 ×106/mm3
Hemoglobin 8–16 g%
PCV 24–50 %
Sumber: Banks (1993) dan Frandson (1996)
Nilai hematokrit merupakan petunjuk yang sangat baik untuk menentukan jumlah eritrosit dan kadar hemoglobin dalam sirkulasi darah. Pemeriksaan sel
darah merah dapat dilakukan dengan memeriksa tiga parameter, yaitu jumlah total sel darah merah, nilai hematokrit, dan kadar hemoglobin. Jumlah sel darah merah dan konsentrasi hemoglobin mengindikasikan morfologi sel darah merah, sedangkan nilai hematokrit menunjukan perbandingan sel darah merah dengan plasma protein (Meyer et al. 1992).
2. 8. Hemoglobin
Hemoglobin adalah pigmen eritrosit yang terdiri atas protein kompleks terkonjugasi yang mengandung zat besi yang berguna untuk memberi warna merah pada eritrosit. Fungsi utama hemoglobin adalah untuk mengangkut oksigen dan karbondioksida dalam darah (Cunningham 1997). Hemoglobin merupakan protein pengangkut oksigen paling efektif dan terdapat pada hewan-hewan bertulang belakang (vertebrata). Zat besi dalam bentuk Fe2+ pada hemoglobin memberikan warna merah pada darah. Dalam keadaan normal 100 mL darah mengandung 15 g hemoglobin yang mampu mengangkut 0,03 g oksigen.
BAB III
METODE
3. 1. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan selama dua bulan, yang dimulai pada bulan Mei sampai dengan Juni 2011. Penelitian ini dilakukan di dua tempat, yakni pengambilan sampel darah dilakukan di kandang Mitra Tani yang beralamat di Jalan Manunggal Baru No. 1, Desa Tegalwaru, Kecamatan Ciampea, Kabupaten Bogor, kemudian analisis sampel darah dilakukan di Laboratorium Fisiologi, Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi (AFF), Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
3. 2. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain spuid 3 mL, seperangkat alat ultrasonography (USG), tabung reaksi, gelas objek, hemositometer, selotip, marker, kertas label, kertas saring atau tisu, kapas, tabung kapiler, alat penghitung, adam micro-hematocrit reader, penyumbat tabung kapiler, alat sentrifugasi, tambang, selang penanda berwarna, mikroskop cahaya, oven, dan kotak pendingin.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini di antaranya 18 domba betina, sediaan hormon prostaglandin F2α (PGF2α), pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) dan human chorionic gondadotropin (hCG), pengencer NaCl 0,9%, alkohol 70%, antikoagulan ethilen diamine tetra-asetate (EDTA), vitamin B kompleks, dan anthelmintik (Albendazole).
3. 3. Tahap Persiapan 3. 3. 1. Hewan Percobaan
Tahap pertama dari persiapan hewan coba adalah menyiapkan domba betina sebanyak 18 ekor yang diperoleh dari kandang Mitra Tani. Domba tersebut memiliki bobot badan berkisar 18 sampai dengan 23 kg dan telah dewasa kelamin.
3. 3. 2. Aklimatisasi Domba
Pada minggu pertama, domba percobaan dipelihara untuk diaklimatisasikan. Tujuan aklimatisasi ini adalah agar domba beradaptasi terlebih dahulu terhadap lingkungan kandang dan sekitarnya, sehingga dapat menekan tingkat stress seminimal mungkin. Kemudian dilakukan pemeriksaan fisik domba dan diberikan anthelmintik dan vitamin B kompleks. Pemberian anthelmintik dan vitamin bertujuan untuk mendapatkan kondisi domba yang sehat dan bebas dari kecacingan.
3. 3. 3. Kandang, Pakan, dan Minum
Hewan coba ditempatkan pada kandang kelompok dengan konstruksi kandang panggung. Tinggi kandang ini 50 cm dari permukaan tanah dengan tujuan untuk mengurangi paparan gas amoniak yang berasal dari feses dan urin. Domba sebanyak 18 ekor dikandangkan sesuai dengan kelompok perlakuan.
Pakan yang diberikan berupa hijauan dan konsentrat. Pakan diberikan tiga kali sehari. Air minum diberikan secara ad libitum, hal ini untuk mencegah terjadinya dehidrasi.
3. 4. Tahap Pelaksanaan 3. 4. 1. Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini ialah rancangan acak lengkap (RAL) dengan dua perlakuan. Perlakuan pertama ialah domba yang tidak disuperovulasi (kontrol) sedangkan perlakuan kedua ialah domba yang disuperovulasi. Masing-masing kelompok perlakuan terdiri atas sembilan ekor domba.
3. 4. 2. Superovulasi
Perlakuan superovulasi diawali dengan sinkronisasi berahi terhadap seluruh domba pada setiap kelompok perlakuan. Sinkronisasi berahi dilakukan dengan cara menyuntikkan hormon PGF2α (Lutalyse™) secara intramuscular sebanyak dua kali. Dosis PGF2α yang diberikan berkisar 5 sampai dengan 15 mg/kg Bobot badan. Penyuntikkan PGF2α kedua dilakukan dengan selang waktu
sebelas hari dari penyuntikkan pertama. Kelompok domba superovulasi mendapat perlakuan penyuntikkan secara intramuscular menggunakan hormon PMSG dan hCG yang disuntikkan sesaat setelah penyuntikkan PGF2α yang kedua. Kelompok domba kontrol hanya mendapat perlakuan penyuntikkan PGF2α.
Sekitar 24 sampai dengan 36 jam setelah penyuntikkan PGF2α yang kedua, domba berada dalam keadaan berahi. Semua kelompok perlakuan domba dicampur dengan domba jantan, agar terjadi perkawinan. Pencampuran domba jantan ini dilakukan selama dua hari. Pencampuran dengan pejantan dilakukan dengan membagi 18 domba menjadi 2 kelompok dengan masing-masing kelompok terdiri atas 9 betina dan 1 jantan. Tiga puluh hari setelah pencampuran dengan pejantan, dilakukan pemeriksaan kebuntingan menggunakan USG.
3. 4. 3. Pengambilan Sampel
Pengambilan darah dilakukan melalui vena jugularis menggunakan spuid sebanyak kurang lebih 3 mL. Sebelum pengambilan darah, bulu dicukur dan dibersihkan dengan kapas alkohol. Pengambilan darah pada domba dapat dilihat pada Gambar 2.
Sumber: Dokumen pribadi
Gambar 2 Pengambilan darah pada domba melalui vena jugularis.
Darah yang sudah diambil langsung dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah dilapis antikoagulan EDTA. Tabung tersebut kemudian ditutup menggunakan sumbat dan diberi label sesuai kode perlakuan. Setelah itu, sampel
darah tersebut dimasukkan ke dalam kotak pendingin dan dibawa ke laboratorium fisiologi untuk dilakukan pemeriksaan darah.
3. 4. 4. Penghitungan Sel Darah Merah, Hematokrit, dan Hemoglobin.
Penghitungan sel darah merah dilakukan dengan menggunakan metode hemositometer. Metode hemositometer dilakukan dua tahap. Tahap pertama, pipet pengencer yang akan digunakan dibersihkan terlebih dahulu. Sampel darah yang telah diberi antikoagulan EDTA dihomogenisasi supaya sel darah tercampur merata. Dengan menggunakan pipet pengencer, darah yang telah dicampur dengan EDTA dihisap sampai 0,5. Kemudian, pipet dibersihkan dari noda darah yang menempel menggunakan tisu. Setelah itu, ujung pipet dimasukkan ke dalam cairan pengencer NaCl 0,9% dan larutan tersebut dihisap sampai batas tera 101. Aspirator dilepas, pipet diangkat, ujungnya ditutup dengan jempol, dan pangkalnya ditutup dengan jari tengah. Pipet diposisikan mendatar dan dihomogenkan dengan membuat gerakan memutar angka 8. Setelah homogen, cairan tetesan pertama dan kedua dibuang. Tahap kedua, hasil pengenceran dituangkan ke dalam kamar hitung dengan menyentuhkan ujung pipet eritrosit pada tepi kaca penutup. Kemudian, kamar hitung didiamkan beberapa menit agar sel-sel darah merah mengendap pada dasar kamar hitung. Kamar hitung dilihat di bawah mikroskop dengan pembesaran objektif 40 kali. Jumlah sel yang dihitung adalah di lima kotak, yaitu pada pojok kanan atas dan bawah, pojok kiri atas dan bawah, serta satu kotak yang tepat berada di tengah. Jumlah sel darah merah ialah jumlah dari penghitungan lima kotak tadi dikalikan dengan 10 000 per mm3. Kamar hitung Neubauer dapat dilihat dalam Gambar 3.
Sumber: Bamualim (2008)
Penghitungan nilai hematokrit atau Pack Cell Volume (PCV) dilakukan menggunakan Adam Mikrohematocrit Reader. Tabung mikro yang digunakan adalah tabung mikro dengan panjang 7 cm dan diameter 0,1 mm. Sampel darah diambil dengan menempelkan bagian ujung dari tabung mikro tersebut ke dalam darah. Posisi ujung tabung mikro hampir mendatar dan bagian ujung tabung yang lain dikosongkan kira-kira 1 cm. Bagian ujung tabung disumbat. Setelah itu, tabung mikro yang berisi sampel darah tersebut disentrifuse selama 4 sampai dengan 5 menit dengan kecepatan 10 000 rpm (rotasi per menit). Hasil sentrifugasi dibaca menggunakan Adam Mikrohematocrit Reader.
Pengukuran nilai hemoglobin dilakukan dengan menggunakan metode Cyanmethemoglobin. Metode Cyanmethemoglobin didasarkan pada pembentukan cyanmethemoglobin yang intensitas warnanya diukur secara fotometri. Reagen yang digunakan adalah larutan Drabkin yang mengandung Kalium ferrisianida (K3Fe[CN]6) dan kalium sianida (KCN). Ferrisianida mengubah besi pada hemoglobin dari bentuk ferro ke bentuk ferri menjadi methemoglobin yang kemudian bereaksi dengan KCN membentuk pigmen yang stabil yaitu sianmethemoglobin. Intensitas warna yang terbentuk diukur secara fotometri pada panjang gelombang 540 nm.
3. 5. Variabel yang Diamati
Variabel yang diamati dalam penelitian ini terdiri atas jumlah leukosit dan eritrosit, nilai hematokrit, dan kadar hemoglobin.
3. 6. Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan metode analisis One-Sample T Test untuk melihat interaksi dari masing-masing faktor perlakuan yang