C. Prosedur Penelitian
3) Karakteristik Steroid Teripang
Karakteristik ekstrak steroid dari teripang selain aktivitas biologisnya (androgenik) pada anak ayam jantan adalah sebagai berikut:
a. Warna; warna ekstrak teripang berbeda antara ekstrak yang didapat dari daging dengan jeroan. Ekstrak daging teripang berwarna putih kehijauan, sedangkan ekstrak jeroan berwarna putih kecoklatan.
b. Derajat keasaman (pH); pH ekstrak cenderung netral, yaitu pada kisaran 7,3-7,6.
c. Kelarutan; senyawa steroid teripang lebih larut dalam pelarut bipolar (aseton), dibanding pada pelarut polar (air dan metanol) dan pelarut non polar (diklorometan/DCM).
d. Stabilitas; secara kualitatif senyawa aktif pada ekstrak teripang tetap stabil setelah penyimpanan selama 10 bulan pada suhu rendah (+ -10oC).
yang menunjukkan bahwa ekstrak tersebut masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji (Staphylococcus aureus).
e. Antibakteri; screening dengan bakteri uji menunjukkan bahwa ekstrak teripang bersifat antibakteri terhadap Staphylococcus aureus (bakteri gram positif). Diameter zona bening yang terbentuk sebesar 14 mm. Hasil uji menunjukkan bahwa ekstrak teripang tidak menghambat pertumbuhan E. coli, dan Pseudomonas aeruginosa (keduanya bakteri gram negatif). Hal ini menunjukkan bahwa senyawa steroid dari teripang mampu menghambat pertumbuhan bakteri gram positif tetapi tidak pada bakteri gram negatif.
f. Antikapang; ekstrak teripang bersifat menghambat pertumbuhan Candida maltosa. Agar diffusion assay dengan ekstrak kasar (ekstrak aseton) sebanyak 2 mg menghasilkan zona bening pada pertumbuhan C. maltosa
dengan diameter 15 mm, sedangkan ekstrak metanol hanya menghasilkan zona bening sebesar 8 mm (Gambar 9). Hasil bioassay ini menunjukkan bahwa senyawa steroid dari teripang, selain mempunyai aktivitas biologis sebagai aprodisiaka juga dapat menghambat pertumbuhan kapang.
Gambar 9 Agar diffusion assay pada C. maltosa
A. Ekstrak aseton, B. Ekstrak metanol
E. Purifikasi Awal dengan Membran Nanofiltrasi 15 mm
A
B 8 mm
Senyawa steroid mempunyai bobot molekul sekitar 300 Da (Bischof dan Islami 2003). Bobot molekul ini cenderung sangat kecil dibandingkan dengan bobot molekul hormon dari golongan protein, yaitu lebih dari 5000 Da.
Untuk proses purifikasi senyawa dengan bobot molekul kecil ini umumnya digunakan kromatografi kolom. Metode ini telah lama digunakan dan cukup efektif untuk memurnikan senyawa target. Namun metode ini sulit dipraktekkan pada skala yang lebih besar. Oleh karena itu pada penelitian ini digunakan membran nanofiltrasi dengan molecular weight cut-off (MWCO) sebesar 1000 Da (Gambar 10). Penentuan ukuran membran nanofiltrasi yang digunakan ini didasarkan pada bobot molekul steroid, yaitu sekitar 300 Da. Pertimbangan lain adalah untuk mengurangi potensi terjadinya retensi adsorpsi steroid pada membran (Schäfer et al. 2003). Dengan demikian diharapkan terjadinya penyumbatan (fouling) selama proses filtrasi dapat diminimalkan. Dengan spesifikasi membran nanofiltrasi ini maka senyawa steroid target didapat sebagai permeat, sedangkan senyawa pengotor sebagai retentat (yang tertahan).
Gambar 10 Proses filtrasi dengan menggunakan membran nanofiltrasi
Pelarut yang digunakan dalam proses filtrasi ini sama dengan pelarut untuk proses ekstraksi, yaitu aseton. Aseton merupakan pelarut organik, karena itu membran yang digunakan adalah membran keramik. Penggunaan membran non keramik, misalnya membran polimer organik seperti selulose asetat, akan menyebabkan partikel membran terlarut. Oleh karena itu, penentuan jenis
membran yang akan digunakan harus disesuaikan dengan jenis pelarut yang digunakan.
Proses filtrasi senyawa steroid ini dilakukan dengan tekanan 1,5 bar dan laju alir permeat 0,05 ml/dt untuk ekstrak dari daging teripang dan 0,08 ml/dt untuk ekstrak dari jeroan. Setelah proses filtrasi warna larutan permeat baik ekstrak dari daging maupun dari jeroan menunjukkan intensitas warna kuning kehijauan yang sama (Gambar 11).
Gambar 11 A. Ekstrak sebelum proses filtrasi, B. Permeat setelah proses filtrasi
Selama proses filtrasi, pada larutan terbentuk busa yang cukup banyak (Gambar 12). Hal ini menunjukkan bahwa larutan tersebut mengandung saponin. Banyak peneliti terdahulu yang menyatakan bahwa teripang mengandung senyawa steroid saponin, diantaranya aktif sebagai antibakteri dan anti-inflamasi, serta cytotoxic (Idid et al. 2001; Popov 2002; Jha dan Zi-rong 2004).
B A
Gambar 12 Busa terbentuk selama proses filtrasi
F. Bioassay pada Anak Ayam Jantan
Bioassay dengan menggunakan anak ayam jantan bertujuan untuk mengetahui aktivitas biologis senyawa steroid dalam ekstrak teripang sebagai aprodisiaka alami. Pengaruh senyawa steroid sebagai aprodisiaka alami nampak dari perkembangan jengger anak ayam jantan sebagai hewan percobaan (Gambar 13). Selain itu dari bioassay ini dapat diketahui pengaruh negatif ekstrak teripang terhadap hewan percobaan, seperti penurunan bobot badan dan tanda-tanda keracunan.
1) Serapan N Pakan secara In Vivo dan Pengaruhnya terhadap Bobot Badan
Pada percobaan serapan N pakan secara in vivo didapatkan hasil analisa kandungan N pada feses anak ayam seperti disajikan pada Gambar 14. Kandungan N tertinggi terdapat pada kontrol positif, yaitu sebesar 5,15 %, sedangkan kandungan terendah terdapat pada perlakuan dengan ektrak teripang kering, yaitu sebesar 3,09 %. Data ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak dari teripang tidak menghambat proses absorpsi N.
Gambar 14 Kandungan N pada feses anak ayam jantan
Keterangan: A. Kontrol negatif, B. Ekstrak dari teripang kering, C. Ekstrak dari teripang basah, D. Kontrol positif, E. Aprodisiaka komersial, F. Tepung teripang kering
Seperti halnya pada hewan-hewan lain secara umum, efektif tidaknya serapan N dapat diketahui dari perkembangan bobot badan ayam. Namun demikian, pemberian senyawa obat pada hewan percobaan, dalam hal ini ayam juga dapat mempengaruhi (cenderung menurunkan) bobot badannya. Hal ini disebabkan beberapa jenis obat dapat menyebabkan metabolisme tubuh terganggu, seperti menurunkan absorpsi protein, beberapa vitamin dan zat gizi lainnya.
Perkembangan bobot badan hewan uji pada penelitian ini disajikan pada Gambar 15. Dari gambar tersebut diketahui bahwa rata-rata tertinggi pertambahan bobot badan terjadi pada perlakuan yang diberi ekstrak dari teripang dalam bentuk kering, yaitu sebesar 57,62 gram. Nilai ini lebih tinggi dari pertambahan bobot badan kelompok kontrol, yaitu sebesar 56,43 gram. Sedangkan rata-rata terendah pertambahan bobot badan terdapat pada
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 N Kasar (%) A B C D E F Perlakuan 5,03+0,38 3,87+0,28 5,15+0,14 3,09+0,14 4,18+0,28 4,26+0,28
perlakuan dengan tepung teripang kering, yaitu sebesar 50,48 gram. Pada kontrol positif, baik dengan metil testosteron maupun aprodisiaka komersial memperlihatkan pertambahan bobot badan yang cenderung rendah, yaitu masing-masing 52,38 gram dan 52,86 gram.
0 150 300 450 600 750 900 1050 0 5 10 15 20 Waktu (hari) Bob o t Ba d a n (g) A B C D E F
Gambar 15 Perkembangan bobot badan anak ayam jantan selama percobaan
Keterangan: A. Kontrol negatif, B. Ekstrak dari teripang kering, C. Ekstrak dari teripang basah, D. Kontrol positif, E. Aprodisiaka komersial, F. Tepung teripang kering
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kadar testosteron yang tinggi, yaitu pada kontrol positif dapat menghambat perkembangan bobot badan hewan uji. Hal ini disebabkan karena kadar testosteron yang tinggi dapat menurunkan pertumbuhan bobot badan dengan jalan menghambat katabolisme lemak dan anabolisme protein yang terjadi di beberapa jaringan tubuh seperti otot, ginjal, hati dan lain-lain (Turner dan Bagnara 1976).
2) Pengaruh Ekstrak Teripang terhadap Bobot Hati, Limpa dan Bursa