BAB III. METODE PENELITIAN
C. Cara Kerja
a. Pengambilan sampel darah
Sampel darah diambil dari vena jugularis eksternal individu-individu sapi secara venepuncture, menggunakan venoject dengan ukuran 10 mililiter (mL) yang berisi 2,5 ml 200 mM EDTA untuk mencegah terjadinya pembekuan darah.
Darah disimpan di dalam freezer bertemperatur -20oC untuk siap digunakan dalam penelitian dan referensi di kemudian hari.
b. Ekstraksi DNA
DNA diekstraksi dari total darah dengan menggunakan teknik Wizard Genomic Purification System (Promega, Madison USA). Tahapan ekstraksi merujuk pada Wizard Genomic DNA Purification Kit dari Promega, yaitu sebagai berikut:
DNA diekstraksi langsung dari total darah.
Sejumlah 300 mikroliter total darah dimasukkan ke dalam 1,5 mL tabung mikrosentrifus steril yang telah diisi 450 cell lysis solution, yang berguna untuk melisiskan dinding sel, dicampur dan diinkubasi pada temperatur kamar selama 10 menit untuk melisiskan sel darah merah yang mungkin masih tercampur.
Sel darah putih kemudian di sentrifugasi pada kecepatan 14.000 g (gravitasi) selama 20 detik pada temperatur kamar untuk memperoleh endapan sel darah putih.
commit to user
Supernatan diambil dan dibuang, kemudian tabung mikrosentrifus yang berisi endapan sel darah putih diberi getaran ±3-5 menit menggunakan vortex agar sel-sel darah putih memisah secara sempurna.
Sejumlah 150 nuclei lysis solution ditambahkan ke dalam tabung berisi suspensi tersebut, kemudian dicampur dengan menggunakan pipet sebanyak 5-6 kali untuk melisiskan sel-sel darah putih.
Selanjutnya ditambahkan 1 RNase ke dalam lisat nukleus, dicampur dan diinkubasi selama 15 menit pada temperatur 37oC.
Setelah itu sampel didinginkan pada temperatur kamar selama 5 menit, yang kemudian ditambahkan dengan 60 protein precipitation solution untuk membentuk presipitat protein ke dalam lisat, kemudian dihomogenkan dengan menggunakan vortex selama 10-20 detik, selanjutnya disentrifugasi pada 14.000 g selama 3 menit untuk membentuk endapan protein.
Supernatan diambil dan dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifus steril baru yang sebelumnya telah diisi dengan 150 isopropanol.
Campuran yang diperoleh dicampur dengan sempurna dengan membolak-balikkan tabung sampai terbentuk materi seperti benang berwarna putih.
DNA kemudian disentrifugasi pada 14.000 g selama 1 menit pada temperatur kamar.
Supernatan dibuang, lalu ditambahkan 300 etanol 70% pada temperatur kamar, kemudian tabung berisi larutan DNA dan etanol ini di bolak-balik untuk mencuci endapan DNA dan juga sisi-sisi dinding tabung
DNA diendapkan dengan sentrifugasi pada 14.000 g pada temperatur kamar, etanol diambil dengan sangat hati-hati, kemudian tabung mikrosentrifus dibalik di atas kertas tisu dan dibiarkan terbuka sampai kering.
Setelah kering 100 DNA rehydration solution ditambahkan ke dalam tabung dan DNA direhidrasi dengan cara inkubasi pada inkubator pada temperatur 65oC selama 1 jam.
DNA yang diperoleh kemudian disimpan pada temperatur 2-8oC sampai penggunaan berikutnya.
c. Uji Kuantitas DNA hasil Ekstraksi
Menurut Ratnayati et al. (2009) Uji kuantitas DNA hasil ekstraksi dapat dilakukan dengan metode spektrofotometri pada panjang gelombang 260 nanometer (nm). Diawali dengan pengukuran tingkat kemurnian DNA dengan pengukuran rasio pembacaan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm (A260/A280). Selanjutnya sampel DNA diukur serapannya pada panjang gelombang 260 nm. Sebagai blangko, larutan yang digunakan adalah akuades. Menurut formula yang digunakan dalam perhitungan menggunakan alat RNA/DNA calculator menyatakan bahwa absorbansi 260 1,0 sesuai untuk 50µg/mL DNA murni untai ganda, maka kadar DNA sampel dapat dicari melalui perhitungan berikut:
X (µg/mL) = A260.50 µg/mL 1,0
Keterangan :
X : Kadar DNA yang dicari
A260: Absorbansi sampel DNA pada panjang gelombang 260 nm.
Uji kuantitas DNA sangat diperlukan, hal ini berkaitan dengan apakah DNA yang kita dapatkan dari hasil ekstraksi cukup untuk diperlakukan pada tahapan replikasi DNA dengan metode polimerase chain reactions.
d. Optimasi dan amplifikasi DNA dengan PCR
Optimasi PCR dilakukan dengan mencoba dan meneliti beberapa variabel seperti konsentrasi primer dan temperatur annealing yang digunakan untuk PCR, hal ini dilakukan dengan tujuan untuk memperoleh produk PCR yang optimal.
Tabel 1: Detail 5 lokus mikrosatelit yang digunakan
F= Forward Primer dan R= Reverse Primer
Amplifikasi DNA dilakukan dengan Polimerase Chain Reaction (PCR).
Amplifikasi dilakukan dengan mencampur 12 Go Tag Green Master Mix 2X, DNA, dan 1 primer dengan 0,5 untuk masing-masing primer,
Locus Primers Sequence Chrom.
Number
nuclease free water sampai 25 . Reaksi PCR menggunakan Thermocycle (Applied Biosystem) yang diawali dengan initial denaturation selama 5 menit pada temperatur 95oC. Selanjutnya siklus akan berulang sampai 30 siklus, yang diawali dengan second denaturation selama 90 detik pada temperatur 95oC, annealing primer selama 90 detik pada temperatur yang disesuaikan dengan temperatur primer, yaitu 55oC untuk BM1824, 59oC untuk ETH225, 60oC untuk TGLA227, 55oC untuk INRA005, dan 55oC untuk MM12, siklus akan berakhir setelah proses extention pada suhu 72oC selama 90 detik. Setelah siklus berakhir selanjutnya dilanjutkan dengan final extention selama 5 menit pada temperatur 72oC dan terakhir adalah pendinginan pada temperatur 4oC sampai waktu yang tidak ditentukan.
e. Uji Kualitas DNA hasil PCR
Hasil amplifikasi difraksinasi dengan elektroforesis gel urea poliakrilamid 12% (Tegelstrom, 1986). Gel Urea Poliakrilamid 12% dibuat dengan mencampurkan bahan-bahan berikut: 7,2 gram urea, buffer TBE 10X 1,5 mL, dan 5,6 mL 30% akrilamid:bis (19:1) pada gelas beaker, selanjutnya ditambahkan dengan aquades steril sampai 15 mL. Selanjutnya larutan dipanaskan dalam microwave pada suhu tinggi selama 10 detik. Tujuan dari pemanasan ini hanya untuk melarutkan urea. Setelah larutan tercampur sempurna kemudian ditambahkan 75 10% ammonium persulfate (APS) dan baru setelahnya ditambahkan dengan 7,5 N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)
larutan poliakrilamid 12% segera dituangkan ke dalam cetakan. Untuk resep dengan volume 15 mL digunakan sepasang cetakan dengan ukuran 7x10 cm.
Tahap selanjutnya adalah persiapan sampel. Denaturasi sampel dilakukan pada suhu 95oC selama 2 menit dan dilanjutkan dengan mendinginkannya dalam pecahan es. Selanjutnya sampel dimasukkan ke dalam sumuran dan dicatat pada note book sesuai dengan nama sampel dan posisinya dalam sumuran, harus dipastikan bahwa tahapan ini tidak lebih dari 20 menit supaya sampel tetap berada dalam keadaan dingin. Selanjutnya power supply dinyalakan dan diatur pada 125 volt dan 400 miliamper. Go taq green master mix mengandung dua pewarna (biru dan kuning) yang juga berfungsi sebagai pemberat (loading dyes). Pewarna biru bermigrasi pada laju yang sama, yaitu pada 3-5 kilo basepairs (kb) fragmen DNA dan pewarna kuning bermigrasi lebih cepat dari pada primer (< 50 bp).
Selanjutnya power supply dimatikan dan buffer dapat dikosongkan dari dalam tangki elektroforesis. Selanjutnya, gel dipindahkan perlahan dari plate dan dipastikan supaya gel tetap dalam keadaan utuh dan baik. Gel yang telah terlepas dari plate dapat direndam dalam larutan ethidium bromide selama kurang lebih 15-30 menit. Hasil yang diperoleh menggunakan gel urea poliakrilamid dengan pewarnaan ethidium bromide menunjukkan hasil pita yang tidak buram seperti yang biasa ditemukan pada mikrosatelit nukleotida di- dan tri- yang banyak menyulitkan dalam penilaian (Machado et al., 2003).
Gel poliakrilamid 12% sesuai untuk pemisahan fragmen DNA dengan ukuran 40-200 bp (basepairs). Elektroforesis gel poliakrilamid mampu memisahkan DNA lebih sempurna dengan jumlah sampel yang dibutuhkan lebih
sedikit (Allen et al., 1984). Hasil pemisahan fragmen DNA dideteksi dengan gel doc. Pita hasil amplifikasi kemudian dicatat dan diberi nilai.
f. Penentuan posisi pita Mikrosatelit DNA
Jika terdapat dua pita maka sampel tersebut bersifat heterozigot dan jika terdapat satu pita maka bersifat homozigot. Untuk memudahkan penilaian, pita yang paling bawah diberi sandi A dan selanjutnya B, C, D, dan seterusnya sampai pita paling atas. Asumsi yang mendukung yaitu semua pita yang memiliki laju sama merupakan alel yang homolog (Nei, 1987).
g. Analisis data
Keragaman genotipe tiap-tiap individu dapat ditentukan dari pita-pita DNA yang ditemukan. Masing-masing sampel dibandingkan berdasarkan ukuran (marker) yang sama dan dihitung frekuansi alelnya. Frekuensi alel dihitung berdasarkan rumus Nei, (1987):
Xi = (2nii + Σnij)/(2n) dimana: Xi = frekuensi alel ke-i
nij = jumlah individu yang bergenotip ij nii = jumlah individu yang bergenotip ii n = jumlah sampel
Derajat heterozigositas (ĥ) dihitung berdasarkan frekuensi alel pada tiap lokus DNA dengan rumus Nei, (1987):
ĥ = 2n (1 - ΣXi2)/(2n – 1)
commit to user n
PIC = 1 - ∑ Pij2
j=1
di mana: Xi = frekuensi alel
ĥ = nilai heterozigositas lokus
Perhitungan nilai Fixation Index, frekuensi alel, Jumlah alel, effective allele number, observed homozygosity, expected homozigosity, observed heterozigosity, expected heterozigosity, dan shannon informations index diestimasi dengan program POPGENE Versi 1.31.
Botstein et al. (1980), menjelaskan bahwa nilai PIC (Polymorphism Informations Content) untuk lokus mikrosatelit dihitung dengan formula:
dimana ij merupakan frekuensi alel i dan j.
commit to user
Analisis Data (POPGENE Versi 1. 31
Skoring Pita DNA (Nei, 1987)
Dokumentasi gel elektroforesis (Gel Doc)
Staining Ethidium Bromide Elektroforesis Gel Polyacrylamid 12%
Uji Kualitas DNA Uji Kuantitas DNA
(Spectrofotometri)
Isolasi DNA
(Wizard Genomic Purification Kit, (Promega, USA))
Elektroforesis Gel Agarose 1%
Cek DNA hasil lisis (Teknik Venopuncture)
Staining Ethidium Bromide
( - ) ( + )
Amplifikasi DNA (PCR)
commit to user BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Keragaman genetik intra spesies
Dari hasil penelitian diperoleh data genotipe dari spesies Sapi Peranakan Ongole dan Sapi Madura seperti yang tertera pada tabel 2 dibawah ini.
Tabel 2. Hasil pembacaan genotipe pita DNA Sapi Peranakan Ongole dan Sapi Madura pada gel poliakrilamid 12% dengan pewarnaan ethidium bromide.
No.
Individu
Sapi Peranakan Ongole Sapi Madura
TGLA
Berdasarkan tabel diatas dapat dilihat bahwa semua lokus mikrosatelit (TGLA227, ETH225, BM1824, INRA005, dan MM12) menunjukkan adanya variasi genotipe kecuali untuk lokus TGLA227 pada Sapi Peranakan Ongole yang semua sampelnya bergenotipe seragam (AB). Variasi genotipe yang muncul pada lokus-lokus tersebut menunjukkan adanya polimorfisme. Variasi terbanyak ditemukan pada jenis Sapi Peranakan Ongole dengan genotipe AD, CD, CE, AB, AC dan BC pada lokus MM12, sedangkan pada Sapi Madura variasi terbanyak
MM12. Lokus TGLA227 untuk spesies Sapi Peranakan Ongole menunjukkan tingkat variasi yang sangat rendah, dapat dilihat bahwa seluruh individu bergenotipe AB. Lokus ETH225 hampir menunjukkan data yang serupa dengan lokus TGLA227, dari 20 sampel yang dipakai hanya individu nomor 5 yang menunjukkan genotipe berbeda (AB), lainnnya didominasi dengan genotipe AA, yang membedakan dengan lokus TGLA227 adalah bahwa genotipe pada lokus TGLA227 bersifat heterozigot sedangkan genotipe lokus ETH225 bersifat homozigot.
Gambar 6. Sketsa pola elektroforesis sampel Sapi Peranakan Ongole (PO) pada lokus MM12, no 1-20 secara berurutan bergenotipe AD, AD, AD, AD, AD, AD, AD, AD, CD, CE, AB, AC, BC, BC, BC, BC, BC, BC, BC, BC.
Tabel 2 juga menunjukkan fakta bahwa pada beberapa individu Sapi Peranakan Ongole dan Sapi Madura masih merupakan individu murni, hal ini ditunjukkan dengan adanya dominasi genotipe homozigot seperti AA pada lokus ETH225 untuk Sapi Peranakan Ongole. Individu homozigot diartikan juga bahwa individu tersebut merupakan individu murni, belum terjadi perkawinan silang dengan spesies lain. Individu murni dapat diperoleh dari perkawinan secara in
Marker 10 bp 40 bp
10 bp 80 bp
1 20
breeding, dengan cara ini akan diperoleh individu-individu yang tetap terjaga kemurniannya dari tetua sampai keturunannya.
Tabel 3. Variasi dan frekuensi alel intra spesies PO dan Madura pada 5 lokus mikrosatelit.
Variasi serta frekuensi alel pada setiap spesies untuk setiap lokus disajikan pada tabel 3 diatas. Variasi alel terbanyak ditemukan pada lokus MM12 yaitu mencapai alel E, sedangkan variasi terendah ditemukan pada lokus INRA005 dan BM1824 yang hanya mencapai variasi alel C. Jika dilihat adanya variasi pada kelima lokus mikrosatelit yang digunakan pada penelitian ini maka prosentase polimorfisme mencapai 100%, hal ini dikarenakan semua lokus menunjukkan adanya variasi alel. Pada Sapi Peranakan Ongole lokus ETH225 menunjukkan adanya dominasi frekuensi alel A yaitu sebesar 97%. Lokus TGLA227 menunjukkan keseimbangan frekuensi antara alel A dan alel B yaitu masing-masing sebesar 50%. Lokus BM1824 juga menunjukkan dominasi alel A yaitu sebesar 87% sedangkan untuk alel B dan C masing-masing 5% dan 7%. Lokus INRA005 frekuensi alel A, B, dan C yang didapatkan hampir seimbang, yaitu 30%, 47%, dan 22%. Lokus MM12 dengan variasi alel terbesar tidak ditemukan dominasi alel tertentu karena frekuensi alel hampir sama antara alel A, B, C, D,
Alel Spesies
Lokus
TGLA227 ETH225 BM1824 INRA005 MM12
Alel A PO
yang secara berurutan yaitu sebesar 25%, 22%, 27%, dan 22%, sedangkan nilai terendah ditemukan pada alel E dengan frekuensi alel 2%. Pada Sapi Madura dominasi frekuensi alel terdapat pada alel A (lokus TGLA227 sebesar 62%, ETH225 dan INRA005 sebesar 50%, BM1824 sebesar 55%), kecuali untuk lokus MM12 frekuensi terbesar ditemukan pada alel B yaitu sebesar 35%. Jika diperhatikan kombinasi paling banyak ditemukan pada alel A, sehingga dapat disimpulkan bahwa variasi sifat yang muncul pada Sapi Peranakan Ongole maupun Sapi Madura sebagian besar dikendalikan oleh kerja alel A.
Tabel 4. Parameter keragaman genetik intra spesies PO dan Madura pada 5 lokus mikrosatelit.
Keterangan: Na.: Observed number of alleles; Ne.: Effective number of alleles [Kimura and Crow (1964)]; I.: Shannon's Information index [Lewontin (1972)]; OHm.: Observed Homozigocity;
EHm.: Expected Homozigosity, EHt.: Expected Heterozigosity, OHt.: Observed Heterozigocity.
PIC.: Polymorphism Information Content.
Jumlah alel, observed homozygosity, expected homozigosity, observed heterozigosity, expected heterozigosity , effective number of alleles, dan shannon’s informations index disajikan pada tabel 4. Semua loci menunjukkan adanya polimorfisme, dan jumlah alel yang diperoleh bervariasi antara 2 (TGLA227 dan ETH225) sampai 5 (MM12), rata-rata jumlah alel untuk Sapi Peranakan Ongole
sebesar 3,00 sedangkan untuk Sapi Madura sebesar 3,80. Jumlah alel per lokus perlu diketahui untuk memperkirakan jarak genetik antar populasi spesies. Lokus dengan banyak alel secara umum menghasilkan perkiraan jarak genetik yang lebih tepat dari pada lokus dengan sedikit alel, terutama untuk populasi yang berkerabatan dekat (Kalinowski, 2002). Secara umum dalam usaha peningkatan mutu ternak tidak dianjurkan dua spesies yang berkerabat dekat untuk melakukan perkawinan sedangkan dua spesies yang berkerabatan jauh sangat dianjurkan untuk melakukan perkawinan silang, hal ini dikarenakan akan terjadi aliran gen pada indukan ke keturunannya sehingga akan terbentuk kemantapan genetik yang yang lebih baik pada spesies keturunannya.
Effective number of alleles (Ne) merupakan perkiraan jumlah alel dengan menyesuaikan frekuensinya pada nilai PIC. Ne terendah yaitu 1,05 pada spesies PO (ETH225) dan nilai tertinggi terdapat pada spesies Madura yaitu sebesar 3,85 (MM12). Nilai Ne rata-rata yaitu sebesar 2,25 untuk Sapi Peranakan Ongole dan 2,77 untuk Sapi Madura. Nilai Ne rata-rata yang diperoleh saat ini sedikit lebih rendah dari nilai Ne rata-rata pada Sapi Hariana dan Sapi Hissar yang secara berturut-turut 2,87 dan 2,89 yang diteliti oleh Rehman dan Khan tahun 2009.
Penelitian Karthickeyan (2009) pada Sapi Kangayam (Bos indicus) dari Tamilnadu memiliki nilai Ne rata-rata sebesar 2,90. Nilai effective number of alleles secara keseluruhan lebih kecil dibandingkan nilai observed number of alleles. Satu alasan mengapa nilai effective number of alleles lebih kecil dibanding nilai observed number of alleles (Ne < Na) adalah karena terjadi fluktuasi jumlah populasi pada masa lalu. Juga terdapat kontribusi dari mutasi (delesi) yang terjadi
pada populasi yang diakibatkan oleh mutasi-keseimbangan seleksi (Crow dan William, 1989).
Nilai observed homozigosity (OHm) Sapi Peranakan Ongole memiliki rentan antara 0,00-0,95 sedangkan untuk Sapi Madura antara 0,00-0,25. Nilai expected homozigosity (EHm) Sapi Peranakan Ongole memiliki rentan yang lebih sempit dibandingkan nilai observed homozigosity nya yaitu antara 0,22-0,95 dan Sapi Madura antara 0,24-0,46. Nilai observed heterozigosity (OHt) per lokus untuk Sapi Peranakan Ongole berkisar antara 0,05-1,00 sedangkan untuk Sapi Madura berkisar antara 0,75-0,90. Nilai expected heterozigosity (EHt) Sapi Peranakan Ongole memiliki kisaran antara 0,05-0,77 sedangkan Sapi Madura berkisar antara 0,54-0,76. Kisaran nilai observed heterozigosity yang diperoleh pada penelitian kali ini jauh lebih lebar dibandingkan dengan hasil penelitian Sumantri et al. (2007) pada Sapi Perah Friesian-Holstein di Balai Pembibitan Ternak Unggul Baturaden sebesar 0,6151-0,7303 dan pada lima sapi lokal (Luxi, Nanyang, Jinnan, Qinchuan, dan Yanbian) di Cina yang berkisar antara 0,63-0,86 (Zhou et al., 2005). Perbedaan yang jauh ini disebabkan oleh selain karena bangsa sapinya berbeda juga lokus mikrosatelit yang digunakan pada penelitian terdahulu lebih banyak, yaitu antara 8-10 lokus. Nilai observed heterozigosity rata-rata untuk Sapi Peranakan Ongole adalah sebesar 0,66 dan untuk Sapi Madura sebesar 0,93. Sodhi et al. (2006) melaporkan rata-rata observed heterozigosity pada Sapi Tharparkar dari India sebesar 0,57, sedangkan pada Sapi India Red Kandhari dan Deoni masing-masing sebesar 0,47 dan 5,47 (Sodhi et al., 2005). Ibeagha et al.
(2005), menyatakan bahwa rendahnya nilai observed heterozigosity (0,117) pada
sapi di Kamerun dan Nigeria kemungkinan disebabkan oleh adanya faktor biak dalam.
Data pada tabel 4 menunjukkan fakta bahwa hampir semua lokus untuk masing-masing spesies memiliki nilai observed heterozigosity lebih tinggi dibandingkan expected heterozigosity hal ini menunjukkan terjadinya penurunan heterozigozitas. Nilai observed heterozigosity yang lebih besar dibanding nilai expected heterozigosity dapat merupakan hasil dari masuknya gen dari luar ke dalam populasi yang sedang dipelajari, nilai expected heterozigosity pada populasi yang telah ada tergantung pada penerapan teknik inseminasi buatan (Machuge et al., 1997).
Laju peningkatan heterozigositas diakibatkan oleh adanya silang luar (out breeding) yang tergantung pada perbedaan genetik dari tetuanya. Noor (2000), menjelaskan bahwa out breeding berpengaruh dalam meningkatkan proporsi gen-gen yang heterozigot (individu yang gen-genotipnya memiliki dua gen-gen/ alel yang berbeda) dan menurunkan proporsi gen yang homozigot (individu yang genotipnya memiliki dua gen/ alel yang sama). Faktor-faktor yang mempengaruhi tingginya heterozigot antara lain overdominan (heterosis positif), perbedaan frekuensi gen antara jantan dan betina, perkawinan yang tidak terpilih (assortative mating) sedangkan yang mempengaruhi rendahnya heterozigositas adalah heterosis negatif (gen resesif), “silent” alel, perkawinan dengan kerabat dekat (Baker dan Manwell, 1986).
Persilangan antar ternak yang memiliki hubungan kekerabatan dekat (in breeding) dapat meningkatkan gen-gen yang homozigot (individu yang memiliki
genotipe 2 gen yang sama) dan menurunkan proporsi heterozigositas yang ada (Khan dan Sing, 1990). Semakin jauh hubungan kekerabatan antara kedua ternak, maka makin sedikit kesamaan gen-gennya dan makin besar pula tingkat heterosigozitasnya (Noor, 2000).
Shannon's Information index (Kimura dan Crow, 1964) merupakan informasi terhadap pengukuran diversitas gen. Pada tabel 4 dapat dilihat bahwa nilai shannon's information index pada spesies Sapi Peranakan Ongole secara berurutan adalah 0,69 (TGLA227), 0,12 (ETH225), 0,46 (BM1824), 1,05 (INRA005), dan 1,46 (MM12). Sedangkan untuk Sapi Madura secara berurutan adalah 0,95 (TGLA227), 1,17 (ETH225), 0,99 (BM1824), 1,03 (INRA005), dan 1,44 (MM12). Jika dilihat terdapat beberapa nilai I yang lebih tinggi pada Sapi Madura dibandingkan pada Sapi Peranakan Ongole, misalnya untuk lokus TGLA227, ETH225, BM1824, dan MM12 hal ini berarti terdapat lebih banyak diversitas genetik pada Sapi Madura untuk empat lokus tersebut diatas dibandingkan pada Sapi Peranakan Ongole, sebaliknya untuk lokus INRA005 diversitas genetik lebih banyak ditemukan pada Sapi Peranakan Ongole dibandingkan pada Sapi Madura. I rata-rata untuk spesies Sapi Peranakan Ongole sebesar 0,76 sedangkan pada Sapi Madura sebesar 1,12. Nilai I pada penelitian ini jauh lebih besar apabila dibandingkan dengan penelitian Mufti et al. (2009) terhadap sapi Red Chittagong di Banglades, sapi dari daerah Anwara memiliki nilai I sebesar 0,29. Qin et al. (2010), melaporkan nilai I untuk Sapi lokal di Cina sebesar 0,308 dan 1,606 untuk Sapi Holstein (Movahedin et al., 2010). Pashaei et al. (2009) mengatakan rendahnya keanekaragaman pada Sapi Holstein mungkin
dikarenakan oleh adanya program pemilihan intensif dan sebaliknya sapi asli kurang dipengaruhi oleh pemilihan.
Polimorphism information content (PIC) merupakan pengukuran yang penting terhadap polimorfisme DNA. PIC menggambarkan kemungkinan bahwa keturunan yang didapatkan dari tetua yang membawa alel langka pada lokus tertentu akan memungkinkan berkurangnya genotipe orang tua pada lokus tersebut (Botstein et al., 1980). Nilai PIC Sapi Peranakan Ongole untuk lokus TGLA227 sebesar 0,50, lokus ETH225 sebesar 0,05, lokus BM1824 sebesar 0,24, lokus INRA005 sebesar 0,63, dan untuk lokus MM12 sebesar 0,76. Pada Sapi Madura untuk lokus TGLA227 sebesar 0,53, lokus ETH225 sebesar 0,68, lokus BM1824 sebesar 0,59, lokus INRA005 sebesar 0,62 dan pada lokus MM12 sebesar 0,74. Berdasarkan kriteria Botstein et al. (1980) penanda genetik dengan nilai PIC kurang dari 0,25 (PIC < 0,25) dikategorikan kurang informatif dan yang mempunyai nilai lebih dari 0,5 (PIC > 0,5) dianggap informatif dalam pengkajian populasi genetik.
Berdasarkan standar pemilihan lokus mikrosatelit (Barker, 1994), lokus mikrosatelit setidaknya harus memiliki empat alel untuk dapat dipertimbangkan kegunaannya secara penuh untuk evaluasi diversitas genetik. Hasil yang diperoleh dalam penelitian ini tidak sesuai dengan hasil penelitian Zhou et al. (2005) terhadap lokus mikrosatelit yang sama pada lima jenis ternak lokal di Cina yaitu ETH225, BM1824, pada penelitian yang dilakukan Zhou et al. (2005) lokus ETH225 dan BM1824 keduanya memiliki nilai PIC > 0,5. Penelitian yang dilakukan Sodhi et al. (2006), terhadap Sapi Zebu di India menyebutkan hal yang
sebaliknya, yaitu bahwa nilai PIC untuk lokus ETH225 < 0,5. Penelitian yang dilakukan oleh Karthickeyan et al. (2008), pada Sapi Ongole menyebutkan bahwa nilai PIC untuk lokus INRA005 dan ETH225 > 0,5. Berdasarkan perbedaan data-data tersebut maka dapat diambil kesimpulan bahwa lokus mikrosatelit yang sama memiliki optimasi kerja yang berbeda untuk jenis ternak yang berbeda.
Fixation Index (Fis) atau Wright’s Fixation Index merupakan perhitungan terhadap perkiraan perkawinan in breeding dalam populasi. Data-data terhadap perhitungan nilai Fis (Tabel 5) menunjukkan bahwa Sapi Peranakan Ongole dan Sapi Madura memiliki keragaman genetik yang luas dan juga merupakan ternak yang melakukan perkawinan out breeding secara alami (Karthickeyan et al., 2009), hal ini diindikasikan dengan munculnya nilai Fis negatif yang mencapai 100% pada seluruh lokus yang digunakan.
Tabel 5. Fixation Index (Fis) intra spesies PO dan Madura pada 5 lokus mikrosatelit (Wright, 1978).
Penambahan rasio alel heterozigot dibandingkan dengan alel homozigot dapat menjadi faktor defiasi yang efektif dalam hardy-weinberg equilibrium yang
Alel Spesies
Lokus
TGLA227 ETH225 BM1824 INRA005 MM12
Alel A PO
Fis menghadirkan peningkatan maupun penurunan peringkat frekuensi observed heterozogosity terhadap expected heterozigosity dari -1 ke 1 dan 0 yang dalam hardy-weinberg equilibrium terjadi ketika kedua frekuensinya sama. Nilai Fis
Fis menghadirkan peningkatan maupun penurunan peringkat frekuensi observed heterozogosity terhadap expected heterozigosity dari -1 ke 1 dan 0 yang dalam hardy-weinberg equilibrium terjadi ketika kedua frekuensinya sama. Nilai Fis