BAB III. METODE PENELITIAN
C. Cara Kerja
1. Pengamatan morfologi
Pengamatan morfologi I .batatas.L antara lain: batang, daun, bunga, akar, untuk semua varietas yang diteliti. Pengamatan morfologi batang, akar, daun meliputi bentuk, warna, morfologi tangkai daun juga diamati warnanya, serta mengambil foto dari tanaman tersebut. Untuk morfologi daun tidak hanya bentuknya yang diamati tetapi panjang dan lebarnya juga diukur dengan mistar, demikian juga bunga diukur diameternya dengan jangka sorong .
2.Uji kandungan gula reduksi
Setelah semua bahan dan alat-alat yang akan digunakan disiapkan di laboratorium selanjutnya :
1.Kita ambil umbi I .batatas.L, dibelah dengan pisau dan diambil bagian tengah, diiris, ditaruh di kaca arloji dan di timbang dengan neraca, masing – masing ± 10,00 gr ,untuk enam varietas I .batatas.L yang akan diteliti yaitu varietas Ace, Jegros, Merketek, Naruto, Bogor dan Sembowo. Setiap kali digunakan untuk mengiris pisau dibersihkan.
2. Umbi dipotong tipis-tipis, dengan mortar digerus sampai halus atau diparut. 3. Masing – masing sediaan diencerkan dengan 250 ml aquadest.
4. Selanjutnya disaring dan diambil filtratnya 250 ml.
5. Dari 250 ml filtrat yang ada diambil 5 ml dan diencerkan menjadi 100 ml ( 5 ml + 95 ml aquadest ) dengan pipet pumt .
commit to user
25
6. Dengan pipet pumt juga dari 100 ml (no 5) diambil 1 ml ( setiap kali untuk
mengambil pipet pumt harus dicuci bersih ) ditaruh ditabung reaksi, dengan pipet pumt ditambah 1 ml larutan Nelson C ( campuran Nelson A dan Nelson B dengan perbandingan 25 : 1 ) .
7. Selanjutnya dipanaskan pada waterbath ± 100º C atau kompor listrik selama 20 menit.
8. Setelah itu didinginkan dan ditambah 1 ml larutan arsenomolybdat.
9.Digojog dengan vortex lalu ditambah 7 ml aquadest dan digojog lagi, lalu di masukkan dalam cuvet sampai kira-kira penuh dan masukkan dalam spektrofotometer double. 10.Dengan spektrofotometer pada λ = 540 nm dicatat OD /absorbanse untuk
spektrofotomter single, sedang untuk spektrofotometer double langsung muncul konsentrasinya ( χ ), dimana untuk varietas Ace = 0,02081; varietas Jegros = 0,02137; varietas Merketek = 0,02211; varietas Naruto = 0,02131; Varietas Bogor = 0,02128; dan varietas Sembowo = 0,02093, yang digunakan untuk menghitung % gula reduksi tiap sample.
11. Nomor 2 – nomor 10 dilakukan untuk enam varietas I.batatas.L
tersebut yaitu varietas Ace, Jegros, Merketek, Naruto, Bogor dan Sembowo. 12. Dengan diketahuinya χ ( konsentrasi ) enam varietas I.batatas .L.
yang diteliti, maka dapat diketahui % gula reduksi enam varietas tersebut . 13. Penghitungan % gula reduksi dicari dengan rumus sebagai berikut :
χ X pengenceran X 100 % gula reduksi = mg sample 250 100 Pengenceran = --- X --- 5 1 = 5000 .
commit to user
26
14. Dengan berat masing – masing varietas yang diuji sebagai berikut : A. Varietas Ace = 10,101 mg D. Varietas Naruto = 10,874 mg B. Varietas Jegros = 10,274 mg E. Varietas Bogor = 10,134 mg C. Varietas Merketek = 10,332 mg F. Varietas Sembowo = 10,161 mg Maka % gula reduksinya masing – masing sebagai berikut :
A .Varietas Ace 0,02081 X 5000 X 100 % gula reduksi = 10101 = 1,03 % B .Varietas Jegros 0,02137 X 5000 X 100 % gula reduksi = 10274 = 1,04 % C .Varietas Merketek 0,02211 X 5000 X 100 % gula reduksi = 10332 = 1,07 % D .Varietas Naruto 0,02131 X 5000 X 100 % gula reduksi = 10874 = 0,98 % E .Varietas Bogor 0,02128 X 5000 X 100 % gula reduksi = 10134 = 1,05 % F .Varietas Sembowo 0,02093 X 5000 X 100 % gula reduksi = 10161 = 1,03 %
commit to user
27
3.Uji pola pita isozim.
Pengambilan tumbuhan lengkap; batang, daun, akar, untuk semua varietas
I .batatas.L dari sawah yang akan digunakan untuk uji isozim, dan ditaruh didalam termos es agar tetap segar dan tidak rusak enzimnya, selanjutnya dibawa ke laboratorium. Semua alat yang akan digunakan untuk menguji disediakan di laboratorium dalam keadaan bersih/steril, juga bahan kimia yang dibutuhkan disiapkan semua di laboratorium. Selanjutnya dibuat 2 plat sediaan yang masing – masing untuk uji isozim dengan Peroksidase dan satu plat untuk Esterase. Karena tiap plat terdapat 20 sumuran maka tiap satu plat dapat untuk menguji batang, daun, akar sekaligus enam varietas untuk enzim peroksidase dan satu plat lagi untuk batang, daun dan akar untuk uji enzim esterase. Adapun caranya sebagai berikut: disiapkan semua larutan yang dibutuhkan dan ditaruh dalam erlemeyer sambil membuat kristal es, dengan cara :
1. Dibuat larutan Ekstraksi dengan cara mencampur 1M Tris-HCl pH 7,5= 1 gr , 2 gr glycerol 99 %, Tween 80 = 1 gr serta ditambah Ditiothretol ( DTT ) = 200 mg. Dengan larutan ekstrak dibuat ekstrak batang, daun, akar masing-masing untuk enam varietas. Dengan cara masing-masing organ diambil ± 0,068 gr ditumbuk dalam mortar yang ditaruh diatas serpihan es agar tetap dingin ( ± 4 ºC ) dan diberi larutan ekstrak dengan perbandingan 1 : 3 yaitu 0,068 gr dilumatkan dalam 0,204 ml larutan ekstrak yang diambil dengan mikro pipet. Selanjutnya ekstrak ditaruh didalam ependof yang sudah diberi label. Setiap kali ganti varietas untuk tiap organ, mortar diganti. Setelah ekstrak enam varietas sudah berada dalam ependof berlabel semua, lalu sample dicentrifugasi selama ± 20 menit dengan kecepatan 8500 rpm dalam centrifuge pada suhu ± 4 º C. Selesai 20 menit ependof diambil dan direndam dalam
commit to user
28
serutan es, supernatan yang terbentuk segera dimasukkan dalam slot gel elektroforisis.
2. Dibuat larutan A, B, dan C sebagai berikut : Larutan A campuran dari 5143 mg + 5 ml HCl +temed 0,042 ml. Larutan B : Acrilamide 7200 mg + 60 mg Methylenebisacrylamide. Dan larutan C : 100 ml Amonium persulfat setelah tiga larutan A,B,C tersedia dengan mikro pipet dengan perbandingan 1 : 1 : 2 dibuat Running gel.
3. Dipasang karet pada glass elektroforisis
4. Running gel dimasukkan pada kaca sebanyak 15 ml . 5. Ditambahkan alkohol 1 suntikkan ( ± 1 ml ).
6. Dipanaskan dengan lampu ± 30 menit, sambil menunggu menjadi padat dibuat spacer gel, sebagai berikut: Dengan mikro pipet dibuat larutan spacer gel terdiri dari larutan D, E, F, dengan perbandingan 1 : 2 : 1. Larutan D terdiri dari Trisma Base 857 mg + HCl 5 ml +Temed 0,084ml. Larutan E terdiri dari Acrilamide 1800 mg + 100 mg Methylenebisacrylamide , dan Larutan F merupakan Riboflavin 2 mg .
7. Setelah running gel padat, dibuang alkohol sampai bersih . 8. Dimasukkan spacer gel dan dipasang sample comb .
9. Setelah spacer gel berada diatas running gel dan sudah dipasang sample comb, selanjutkan dipanaskan dengan lampu, dan setelah padat sample comb diangkat sehingga terbentuk lubang-lubang atau sumuran .
10. Lubang atau sumuran yang terbentuk merupakan bekas sample comb dicuci dengan bromophenol sebanyak 2 kali.
11. Setelah itu isi lagi bromophenol dan diangkat separuh
12. Lalu pasang kaca pada bak elektroforisis, tapi sebelumnya kaca bagian
commit to user
29
13. Running bufer terdiri dari Stock buffer 146 ml + aquadest sampai 2920 ml .
Stock buffer dibuat dari 3500 mg Trisma Base + 15000 mg Glycine + 292 aquadest .
14. Selanjutnya diletakkan tangki isi distiled water diatas temperatur controler . 15. Bak elektroforisis diisi running bufer , dibawah larutan bromophenol .
16. Larutan supernatan disuntikan kedalam lubang bekas sample comb, sesuai dengan nomor.
17. Bak elektroforisis diisi running bufer sampai penuh, terus ditutup.
18. Power suply dihidupkan untuk menjalankan proses elektroforisis dengan arus listrik sebesar 100 mili ampere.
19. Proses ini berlangsung ± 3 jam .
20. Setelah itu kaca di lepas dan gel pada kaca juga di lepas dengan cara di potong pakai curter .
21. Lalu gel di taruh di bak plastik terus diberei larutan staining Peroksidase (POD) atau Esterase (EST) .
22. Larutan staining untuk enzim Peroksidase dibuat dari sebagai berikut:
dicampur Trisma base 150 mg +Acetic acid glacial 162 µl +Amino Ethyl Carbozole 45 mg + β Naphtol 30 mg + Acetone 20 ml + 2 ml H2O2 3% .
23. Larutan staining untuk enzim Esterse dibuat dari campuran :
1560 mg NaH2PO4H2O + 285 mg Na2HPO4 + 21 mg Naphtyle propionate + 40 mg Naphtyle acetat dan ditambah 100 mg Fast blue RR salt .
24. Selanjutnya digoyang, difiksasi ( campuran Ethanol absolut atau ethyl alcohol =100 ml + Acetone = 10 ml ) ,
didinginkan dalam kulkas, di keringkan dan akhirnya di amati .
25. Pola pita isozim hasil eletroforisis direkam dengan fotografi, kemudian pola pita digambar dendrogramnya .Pengukuran jarak migrasi (Rf) diukur dari
commit to user
30
jarak pita yang tampak dibagi dengan jarak loding day/ jarak terjauh.