Penambahan jintan hitam memiliki pengaruh terhadap peningkatan respon imun non spesifik kerapu tikus (Cromileptes altivelis) yang diinfeksi Viral Nervous Necrosis.
B. Saran
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan maka penulis menyarankan perlu penelitian lebih lanjut untuk mengevaluasi penambahan jintan hitam dalam pakan pada skala lapang (dalam sistem budidaya di alam) dengan memperhatikan periode pemberian.
DAFTAR PUSTAKA
Ahlquist, P., Noueiry, A.O., Lee, W.M., Kushner, D.B., Dye, B.T. 2003. Host factors in positive-strand RNA virus genome replication. Journal of Virology. 77: 8181-8186.
Alifuddin‚ M.. 1999. Peran Imunostimulan (Lipopolisakarida, Saccharomyces cere-visiae and Levamisol) terhadap Peningkatan Respons Imunitas Ikan Jambal Siam (Pangasius hypopthalmus). (Tesis). Pascasarjana IPB.Bogor. 50 hlm
2002. Imunostimulasi pada hewan aquatik. Jurnal Akuakultur Indonesia. 1: 87-92.
Almendras, J.M.E. and E.S. Catap. 2002. Immunity and Biological Methods of Disease Prevention and Control. SEAFDEC/AQD. Tighbauan Iloilo Philiphine.30 hlm.
Amelia, N., Prayitno. dan B. Slamet. 2012. Pengaruh ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava) untuk menginaktifkan Viral Nervous Necrosis (VNN) pada ikan kerapu bebek (Epinephelus fuscoguttatus). Journal Of Aquaculture Management and Technology. 1: 264 - 278.
Amlacher, E. 1970. Text Book of Fish Disease. D.A.T.F.H. Publication. New York. 302 hlm.
Anderson, D.P. 1992. Immunostimulant, Adjuvant and Vaccine Carrier In Fish: Applications to Aquaculture. Annual Review of Fish Diseases. 21: 281-307. Anderson, D.P. and A.K. Siwicki. 1993. Basic Hematology and Serology for Fish
Health Programs. Asian Fisheries Society. 17 hlm.
Attia, Y.A., A. El-Din., H.S. Zeweil., A.S. Hussein., E.S.M. Qota., and M.A. Arafat. 2008. The effect of supplementation of enzyme on laying and reproductive performance in japanese quail hens feed nigella seed meal.
Journal Poult Sci.45: 110 - 115.
Bashandy, A.E.S. 2006. Effect of fixed oil Nigella sativa on male fertility in
normal and hyperlipidemic rats.Journal Pharmacol. 2: 104 - 109
Bastiawan, D., A. Wahid., M. Alifudin. dan I. Agustiawan. 2001. Gambaran Darah Lele dumbo (Clarias spp.) Yang Diinfeksi Cendawan Aphanomyces sp pada pH yang berbeda. Jurnal Penelitian Indonesia. 7: 44 - 47.
Bond‚ C.E. 1979. Biology of Fish. W. B. Saunders. Toronto.
Boseila‚ A.A.H and A.A.H. Messalam. 2011. Immunostimulant effect of different fractions of Nigella sativa L. seeds againts rabies vaccine. Journal Nature and Science. 9: 90 - 96.
Bowden‚ T.J.‚ Thompson‚ K.D.‚ Morgan‚ A.L.‚ Gratacap‚ R.M.L.‚ Nikoskelainen‚ S. 2006. Seasonal variation and the immune response : Afish perspective. J Fish and Shellfish Immunology. Article in press: 1-12. Chi, S.C., C.F. Lo., G.H. Kou., P.S. Chang., S.E. Peng. and S.N. Chen. 1997.
Mass mortalities associated with Viral Nervous Necrosis (VNN) disease in
two species of hatchery-reared grouper, Epinephelus fuscogutatus and Epinephelus akaara (Temminck & Schlegel). Journal of Fish Diseases. 20: 185 - 193.
Chinabut, S., C. Limsuwan. and Katsuwan. 1991. Histology of Walking Catfish Clarius batracus. IDRC, Canada.
Corbel, M.J. 1975. The immune response in fish: A review. Journal Fish Biol. 7:
539 - 563.
Dorucu, M., S.O. Colak., U. Ispir., B. Altinterim. and Y. Celayir. 2009. The effect of black cumin seeds, Nigella sativa, on the immune response of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Mediterranean Aquaculture Journal. 2: 1-7.
Durani‚ F.R.‚ N. Chand.‚ K. Zaka.‚ A. Sultan.‚ F.M. Khattak.and Z. Durrani. 2007. Effect of different levels of feed added black seed (Nigella sativa L.)
on the Performance of broiler Chicks. Pakistan Journal of Biological Sciences. 10: 4164 - 4167.
Effendi‚. 2003. Peranan Leukosit sebagai AntiInflamasi Alergik dalam Tubuh. Universitas Sumatera Utara. Sumatera Utara.
Ellis, A.E. 1989. The Imunology of Teleost. In: Robert RJ, (ed). Fish Patology. Bailliere Tindall. London 18 hlm.
El-Kadi, A. and O. Kandil. 1986. Effect of Nigella sativa (The Black Seed) on Immunity. Proceeding of the 4th International Conference on Islamic Medicine, Kuwait. Bull Islamic Me. 4: 344-350.
Fange‚ R. 1982. A Comparative Study of Lymphoid Tissue in Fish:
Developmenttal and Comparative Immunology Suplement. Journal Fish Bio. 2: 23 – 33.
Fenner‚ F.J.‚ E.P.J. Gibbs.‚ F.A. Murphy.‚ R. Roil.‚ Studdert. and D.O. White. 1993. Virology Veteriner. Academic Press. California
Galeotti, M. 1998. Some aspects of the application of immunostimulants and a critical review of methods for their evaluation. Journal Appl. Ichthyol. 14:
189 - 199.
Gali-Mustahib‚ A.‚ N. El-Najjar.‚ R. Schneider-Stock. 2007. The medicinal potential of black seed (Nigella sativa) and its components. Advances in Phytomedicine. 2: 133-153.
Ganong, W.F. 1995. Buku Ajar fisiologi Kedokteran (Review of Medical Physiologi). Ed ke-4. Terjemahan P Adianto. EGC. Jakarta.
Grotmol, S., Bergh, Ø., Totland, G.K. 1999. Transmission of viral encephalopathy and retinopathy (VER) to yolksack larvae of the Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus: occurrence of nodavirus in various organs and apossible route of infection. Diseases of Aquatic Organisms. 36:95-106. Guyton, A.C. 1997. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran Edisi 9. Irawati Setiawan
(Penerjemah). Penerbit Buku Kedokteran. EGC. Jakarta.
Haq, A., P.L. Lobo., M. Al-Tufail., N.R. Rama and S.T. Al-Sedairy. 1999. Immunomodulatory effect of Nigella sativa proteins fractionated by ion exchange chromatography. Int J Immunopharmacol. 21: 283-285.
Heemstra‚ P.C. and J.E. Randall. 1993. Vol.16. Groupers of the world (Family Serranidae‚ Subfamily Epinephelinae). FAO Species Catalogue.
Hoffbrand‚ A.V. and J.E. Pettit. 1992. Kapita Selekta Hematologi. Edisi ke-2. Terjemahan I. Darmawan. Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta.
Hutapea, J.R. 1994. Inventaris Tanaman Obat Indonesia (III). Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 163 hlm..
Irianto‚ A. 2005. Patologi Ikan Teleostei. Gajah Mada Universitas Press. Yogyakarta.
Johnny, F., D. Roza., K. Mahardika.,Zafran. dan A. Prijono. 2005. Penggunaan imunostimulan untuk meningkatkan kekebalan non spesifik benih ikan kerapu lumpur (Ephinepelus coioides)terhadap infeksi virus irido. Jurnal Penelitian Perikanan Indonesia. 11: 75 – 83.
LeRoith‚ T. and Ahmed‚ S.A. 2012. Regulatory T Cells and Viral Disease, Inflammation, Chronic Diseases and Cancer - Cell and Molecular Biology, Immunology and Clinical Bases, Dr Mahin Khatami (Ed.), Available from:
Klopp‚ R.‚ W. Schmidt.‚ W. Niemer.‚ M. Werner. and J. Beuth. 2001. Changes in immunological characteristics of white blood cell after administration od standardized mistletoe extract. In Vivo 15: 447 - 458.
Kollner‚ B. and G. Kotterba. 2002. Temperature dependent activation of leucocyte population of rainbow trout Onchorinchus mykiss after intraperitonieal
immunization with Aeromonas salmonicida. Journal Fish & Shellfish Immunology. 12: 35 - 48.
Kordi, M. 2001. Usaha Pembesaran Ikan Kerapu di Tambak. Kanisius. Yogyakarta.
Korsners‚ K. 2008. Nervous Necrosis Virus (NNV) in Farmed Norwegian Fish Species. University of Bergen. Bergen. 86 hlm.
Kresno‚ S.B. 2001. Imunologi Diagnosis dan Prosedur Laboratorium. Edisi Ketiga Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta
Lagler, K.F., J.E Bardach., R.R Miller. dan D.R.M. Passino. 1997. Ichtyology. John Wiley and Sons Inc. New York.
Mady‚ WH.‚ Arafa‚ A.‚ Hussein‚ A.S.‚ Aly‚ M.M.‚ Madbouly‚ H.M. 2013. Nigella Sativa Oil as an Immunostimulant Adjuvant in H5 Based DNA Vaccine of H5N1 Avian Influenza Virus. Global Veterinaria. 10: 663-668. Magnadottir‚ B. 2010. Immunologial Control Fish of Diseases. Mar Biotechnol.
12: PU361-379.
Manning‚ M.J. and Nakanishi ‚T. 1996. The Spesific Immune System : Cellular Defenses. California Academy Press. 45 hlm.
Morvan‚ C.L.‚ D. Troutaud. and P. Deschaux. 1998. Perspective differential effects of temperature on specific and on specific immune defences in fish.
Journal of experimental Biology. 201: 165-168.
Moyle‚ P.B. dan J.J. Cech. 1988. Fishes An Introduction to Icthyology. Prentice Hall, Inc. USA. hlm 559.
Munday, B.L., J. Kwang. and N. Moody. 2002. Betanodavirus infections of teleost fish: a review. J. Fish Dis. 25: 127-142.
Murphy‚ F.A.‚ E.P.J. Gibbs.‚ M.C. Horzinek. and M.J. Studdert. 1999. Verterinary Virology. Third Edition. Academic Press. California. 628 hlm.
Mushiake, K., T. Nishizawa., T. Nakai., I. Furusawa. and K. Muroga. 1994. Control of VNN in striped jack: selection of spawners based on the detection of sjnnv gene by polymerase chain reaction (PCR). Fish Pathol.
29: 177 - 182.
Nabib, R. dan F.H. Pasaribu. 1989. Patologi Dan Penyakit Ikan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi. Pusat Antar Universitas Bioteknologi. IPB. Bogor.
Nagasawa‚ K. And E. Cruz-Lacierda. 2004. Diseases of Cultured Groupers. Goverment of Japan Trust Fund.
Nakai, T., H.D. Nguyen., T. Nishizawa., K. Muroga., M. Arimoto. and K. Ootsuki. 1994. Occurrence of Viral Nervous Necrosis in kelp grouper and tiger puffer.Fish Pathol. 29: 211 - 212.
Nergiz, C. and S. Ötles. 1993. Chemical composition of Nigella Sativa L. seeds. Food Chem. 48: 259 - 261.
Nishizawa, T., M. Furuhashi., T. Nagai., T. Nakai. and K. Muroga. 1997. Genomic Classification Of Fish Nodaviruses By Molecular Phylogenetic Analysis Of The Coat Protein Gene. Appl Environ Microbiol. 63: 1633 - 1636.
Office International des Epizooties (OIE) .2003. Viral Encephalopathy and Retinopathy or Viral Nervous Necrosis. In Diagnostic Manual For Aquatic Animal Diseases, Eds. OIE. Paris. 9 hlm.
Prayitno, B.S. 2002. Peran Budidaya Perairan Khususnya Penanganan Penyakit Ikan Dalam Pengelolaan Sumberdaya Perikanan. Pidato Pengukuhan. Universitas Diponegoro. Semarang.
Putri , R.R., U. Yanuhar. dan A.M. Suryanto. 2013. Perubahan struktur jaringan mata dan otak pada larva ikan kerapu tikus (Cromileptes altivelis) yang terinfeksi Viral Nervous Necrosis (VNN) dengan pemeriksaan scanning electron microscope (SEM). MSPi Student Journal. 1: 1 - 10.
Putri , D.I.L., A. Tumulyadi dan Sukandar. 2013. Tingkah Laku Pemijahan, Pembenihan, Pembesaran Ikan Kerapu Tikus (Cromileptes altivelis) di balai
budidaya air payau situbondo.PSPK Student Journal. 1: 11-15.
Raa‚ J.‚ G. Roestad.‚ R. Engstad. and B. Robertsen. 1992. The Use of Immunostimulant to Increase Resistance of Aquatic Organisms to Microbial Ifections. Disease in Asian Aquaculture 1. Fish Health Sect. Asian Fish Soc. Manila. 12 hlm.
Risamasu, F.J.L. 2008. Inovasi Teknologi Penangkapan Ikan Karang dengan Bubu Dasar Berumpon. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Rombout, J.H., H.B.T. Huttenhuis., S. Picchietti. and S. Scapigliati. 2005. Phylogeny and ontogeny of fish leucocites. Fish and Shellfish Immunology. 19: 441 - 455.
Salem‚ M.L. 2005. Immunomodulatory and theurapeutic properties of the Nigella sativa L. Seed.International Immunopharmacology. 5: 1749 - 1770.
Salem‚ M.L.‚ F.Q. Alenzi. and W.Y. Attia. 2011. Thymoquinone‚ the active ingredient of Nigella sativa seeds‚ enhances survival and activity of antigen- spesific CD-positive T cells in vitro. British Journal of Biomedical Science.
68 :131- 137.
Santika‚ A. 2007. Efektivitas Suplementasi Kromium-Ragi (Cr+3) untuk Meningkatkan Ketahanan Tubuh Ikan Mas terhadap virus Herpes pada suhu rentan KHV. Tesis. Institut Pertanian Bogor. Bogor. 186 hlm
Satheeskumar‚ P.‚ Anatham. and D.S. Kumar. 2011. Haematology and biochemical parameters of different feeding behaviour of teleost fhises from
Vellar estuary‚ India.Comp Clin Pathol: Springer 5 pg.
Satyantini‚ W.H. 2013. Teknologi produksi fikosianin Spirulina Platensis dan pemanfaatannya sebagai imunostimulan pada ikan kerapu bebek (Cromileptes altivelis). (Disertasi). Pascasarjana IPB. Bogor. 126 hlm. Setianto, A. 2011. Usaha Budidaya Ikan Kerapu. Pustaka Baru Press. Yogyakarta. Setiawati‚ M.‚ I. Mokoginta.‚ M.A. Suprayudi. dan W. Manalu. 2007. Pengaruh penambahan mineral Fe pada pakan ikan terhadap status kesehatan ikan kerapu bebek (Cromileptes altivelis). Jurnal Perikanan dan Kelautan. 12: 55- 63.
Shewita‚ R.S. and A.E. Taha. 2011. Effect of dietary supplementation of different levels of black seed (Nigella Sativa L.) on growth performance,
immunological, hematological and carcass parameters of broiler chicks.
World Academy of Science, Engineering and Technology. 77 : 788 - 849. Sohne, K.S., M.K. Kim., J.D. Kim. and I.K. Han. 2000. The role of
immunostimulants in monogastric animal and fish – review. J. Anim. Sci.
13: 1178 - 1187.
Stock‚ W. and R. Hoffman. 2000. White blood cells 1: non-malignant disorders. The Lance. 355: 1351-1357.
Subyakto, S. dan S. Cahyaningasih. 2003. Pembenihan Kerapu Skala Rumah Tangga. Agromedia Pustaka. Jakarta.
Sugianti, B. 2005. Pemanfaatan Tumbuhan Obat Tradisional Dalam Pengendalian Penyakit Ikan. Makalah Pribadi Falsafah Sains (PPS-702). Institut Pertanian Bogor. Bogor
Suhermanto‚ A.‚ S. Andayani. dan Maftuch. 2011. Pemberian total fenol teripang pasir (Holothuria scabra) untuk meningkatkan leukosit dan diferensial leukosit ikan mas (Cyprinus carpio) yang diinfeksi bekteri Aeromonas Hydrophila. Jurnal Kelautan. 4 : 49-56.
Svobodova, Z. and B. Vyukusova. 1991. Diagnostik, Prevention and Therapy of Fish Disease and Intoxication. Research Institute of fish Culture and Hydrobiology Vodnany Czechoslovakia.
Takashima, F. and T. Hibiya. 1995. An Atlas of Fish Histology Normal and Pathological Feature. Second Edition. Takashima F. Kodansha Ltd Tokyo. Tanaka, S., H. Aoki and T. Nakai. 1998. Pathogenicity ofthe nodavirus detected
from diseased sevenband grouper Epinephelus septemfasciatus. Fish Pathol.
33: 31 - 36.
Thiery, R., C. Arnauld. and C. Delsert. 1999. Two isolates of sea bass, Dicentrarchus Labrax L., Nervous Necrosis Virus with distinct genomes. Journal Fish Dis. 22: 201 - 207.
Thiery, R., J. Cozien., J. Cabon., F. Lamour., M. Baud and A. Schneemann. 2006. Induction of a protective immune response against Viral Nervous Necrosis in the European Sea Bass Dicentrarchus labrax by using betanodavirus
virus-like particles. Journal of Virology. 80: 10201 - 10207.
Uribe‚ C.‚ H. Folch.‚ H.‚ R. Enriquez. and G. Morgan. 2011. Innate and adaptive immunity in teleost fish : a review. Verterinari Medicina. 56: 486 - 503. Van de Ligt‚ J.L.G.‚ M.D. Lindeman.‚ R.J. Harmon.‚ H.J. Monegue. and G.L.
Cromwell. 2002. Effect of chromium tripicolinate suplementationon porin immune respone during periparturient and neonatal period. J Animal Siene. 80: 456-466.
Weber, M. dan L.F. de Beaufort. 1940. The fishes of the Indo-Australian Archipelago. Vols. 1-8. Leiden: EJ Brill.
Wedemeyer, G.A. and Yasutke. 1977. Clinical Methods for The Assessment on The Effect of Enviromental Stress on Fish Health. Technical Paper of The US Departement of The Interior Fish and the Wildlife Service. 89: 1-17.
Yanuhar‚ Uun. 2010. The role of immunogenic adhesin Vibrio alginolyticus 49 kDa to molecule expression of majorhistocompatibility complex on receptors of Humpback Grouper Cromileptes altivelis. World Academy of
Science‚ Engineering and Technology. 43: 968 - 973.
Yanuhar‚ Uun. 2011. The function of receptor protein humpback groper (Cromileptes altivelis) in expression and profileration of CD4 and CD8 cells in defence immunity of VNN infection. International Journal of Bioscience Biochemistry and Bioinformatics. 1: 119 – 124.
Yuasa, K., D. Roza., I. Koesharyani., F. Johnny., and K. Mahardika. 2000. General Remarks on Fish Disease Diagnosis. Textbook for the Training Course on Fish Disease Diagnosis.14 hlm.
Zafran, K.I., F. Johnny., K. Yuasa., T. Harada. dan K. Hatai. 2000. Viral Nervous Necrosis in Humpback Grouper Cromileptes altivelis Larvae and Juveniles
In Indonesia. Fish Pat hol. 35: 95 - 96.
Persiapan Penelitian
Persiapan wadah dan ikan uji
Bak ukuran 40x30x30cm sebanyak 4 buah dicuci, didesinfeksi, dan dikeringkan
Diletakkan secara acak dan diberi label
Diisi air dengan padat tebar ikan kakap putih 10 ekor/bak.
Adaptasi ikan selama 7 hari
Pencampuran pakan dengan jintan hitam
Pakan buatan ditimbang sebanyak 1 kg.
Serbuk jintan hitam dicampurkan pada pakan, ditambahkan putih telur sebagai binder dan diaduk.
Pellet dikeringkan dengan cara diangin-anginkan.
Pelaksanaan Penelitian
Pemberian pakan yang dicampur imunostimulan
Pakan diberikan selama 42 hari pemeliharaan
Frekuensi 2x/hari, pukul 08.00 dan 16.00 WIB
Uji Tantang
Uji tantang pada hari ke-38
Penyuntikan filtrat VNN ke tubuh semua ikan uji secara intra peritoneal (i.p) dengan dosis 0,1 ml/ekor.
Pengambilan Darah
Pengambilan sampel darah pada hari ke- 0, 7, 14, 21 dan 4 hari setelah uji tantang
Jarum suntik dan microtube dibilasdengan EDTA 10%
Darah diambil dari 5 ekor ikan, dipilih secara acak pada setiap bak, lalu disimpan di microtube
Parameter pengamatan Hematologi Hematokrit Total Leukosit Diferensial Leukosit Uji Fagositosis Kualitas Air Suhu pH DO Salinitas Analisis Data Deskriptif Penyusunan Laporan Pembuatan Filtrat VNN
Beberapa organ dari kerapu tikus yang positif terserang VNN
Organ tersebut digerus dengan mortar kemudian dimasukkan dalam mikrotube dan ditambah PBS
Mikrotube disentrifuse dengan keepatan 12000 rpm selama 10 menit kemudian disaring dengan milipore
Filtrat disuntikkan kepada kerapu dengan dosis 0‚ 1ml/ekor
yang sehat untuk diamati gejala terserangnya VNN
Ikan yang menunjukkan gejala diambil organnya untuk dibuat filtrat kembali dan dapat disimpan dalam freezer -81oC
Lampiran 2. Data Pengamatan Darah 1. Total Leukosit
Total Leukosit A1 A2 A3 A4
Pengamatan Hari ke-0 26400 27500 30800 28600 Pengamatan Hari ke-7 29700 30800 31900 33000 Pengamatan Hari ke-14 27500 34100 36300 70400 Pengamatan Hari ke-21 28600 37400 68200 77000 Pengamatan Hari ke-42 30800 66000 79200 91300
2. Diferensial Leukosit a. Persentase Monosit
Monosit A1 A2 A3 A4
Pengamatan Hari ke-0 3 4 5 3
Pengamatan Hari ke-7 5 6 8 7
Pengamatan Hari ke-14 2 9 10 12
Pengamatan Hari ke-21 4 8 4 8
Pengamatan Hari ke-42 7 11 9 13
b. Persentase Limfosit
Limfosit A1 A2 A3 A4
Pengamatan Hari ke-0 57 59 58 56
Pengamatan Hari ke-7 58 59 64 63
Pengamatan Hari ke-14 57 63 61 60
Pengamatan Hari ke-21 54 64 59 67
Pengamatan Hari ke-42 57 70 63 74
c. Persentase Neutrofil
Neutrofil A1 A2 A3 A4
Pengamatan Hari ke-0 40 37 37 41
Pengamatan Hari ke-7 37 35 28 30
Pengamatan Hari ke-14 41 28 29 28
Pengamatan Hari ke-21 36 28 37 25
Pengamatan Hari ke-42 36 21 32 13
3. Persentase Hematokrit
Hematokrit A1 A2 A3 A4
Pengamatan Hari ke-0 46.15 36.5 33.33 35.39 Pengamatan Hari ke-7 45.93 45.38 46.51 35.72 Pengamatan Hari ke-14 48.98 41.37 48.37 42.62 Pengamatan Hari ke-21 54.54 47.1 36.36 37.16 Pengamatan Hari ke-42 66 59.61 54.71 41.92
Lampiran 3. Tahap Pemeriksaan Profil Darah 1. Pengambilan Darah
Jarum suntik dan mikrotube 1,5 ml disiapkan
Dibilas dengan larutan EDTA 10% sebanyak 1/3 dari darah yang
diambil
Darah ikan diambil melalui vena caudalis
Darah disimpan dalam mikrotube 1,5 ml
62
Lampiran 3. Tahap Pemeriksaan Profil Darah 2. Perhitungan Total Leukosit
Kaca penutup dipasang pada haemacytometer
Dilanjutkan dengan menghisap larutan turk
hingga skala 11 (pengenceran 1:20)
Haemacytometer dan kaca penutupnya dibersihkan dengan etanol
Sampel darah dihisap dengan pipet berskala hingga skala 0,5
Pipet digoyangkan selama 3 menit agar bercampur homogen
Tetesan berikutnya dimasukkan ke dalam
haemacytometer
Dibiarkan selama 3 menit agar leukosit
mengendap
Bilik hitung diletakkan di bawah mikroskop menggunakan perbesaran
lemah
Perhitungan dilakukan pada 4 kotak besar haemocytometer
64
Lampiran 3. Tahap Pemeriksaan Profil Darah 3. Perhitungan Diferensial Leukosit
Diletakkan setetes darah kerapu tikus
Kaca pemulas disentuhkan pada tetesan darah
kemudian digeser
Kaca obyek yang telah diulas darah dikeringanginkan dan siap diwarnai
Kaca Obyek dibersihkan dengan etanol
Sediaan apus darah diletakkan di baki dengan sediaan apus di sebelah atas
Sediaan tersebut digenangi dengan methanol secukupnya selama 5-10 menit
Kemudian dilanjutkan untuk digenangi dengan giemsa selama 25
menit
Dibilas dengan akuades dan dikeringkan
Gelas obyek diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran kuat
Berbagai jenis leukosit dihitung sepanjang sediaan apusan darah dan dihentikan bila jumlahnya
66
Lampiran 3. Tahap Pemeriksaan Profil Darah 4. Pengukuran Hematokrit
Sampel darah kerapu tikus disiapkan
Darah disedot dengan menggunakan tabung
hematokrit
Salah satu bagian ujung tabung disumbat menggunakan lilin dan
diberi label
Tabung dibungkus dengan tissue dengan cara digulungkan
Dimasukkan ke dalam tabung valcon
Dimasukkan ke dalam mesin sentrifuse pada kecepatan 3500
rpm selama 15 menit
Setelah disentrifuse tabung hematokrit diukur menggunakan penggaris
68
Lampiran 4. Uji Aktivitas Fagositosis
Bakteri yang telah dilemahkan dan sel darah putih kerapu tikus
dicampurkan ke dalam microdilution plate dengan
perbandingan 1:1
Dilakukan pipeting agar homogen dan diinkubasi selama 4 jam
Diambil sekitar 50µl kemudian diteteskan diatas gelas obyek untuk
di ulas
Dilakukan pewarnaan menggunakan giemsa dan diamati dibawah mikroskop
Lampiran 5. Uji Tantang
Filtrat VNN yang telah diisolasi dari kerapu tikus
Dilakukan injeksi VNN terhadap kerapu tikus sebanyak 0,1 ml secara intraperitonial
Ikan dipelihara dan diamati hingga menunjukkan gejala terinfeksi VNN
70
Lampiran 6. Pembuatan Isolat Bakteri Vibrio alginolyticus yang Dilemahkan
Bakteri dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali
Divortex selama ± 1 menit
Disentrifuse pada 3000 rpm selama 15 menit
Bakteri V. alginolyticus di kultur pada media semi solid atau TSA
Bakteri dipanen dan diinkubasi dengan formalin
1‚5% selama 24 jam
Kepadatan Bakteri dihitung menggunakan standar McFarland hingga didapat kepadatan 107 sel/ml
Lampiran 7. Pembuatan Isolat VNN
Beberapa organ diambil dari ikan yang positif terinfeksi VNN
Organ tersebut digerus dengan mortar
Organ yang sudah digerus dimasukkan ke dalam microtube dan ditambahkan dengan PBS steril 1ml
Microtube disentrifuse dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit
72
Air hasil saringan diambil sebanyak 1 ml menggunakan
spuit
Kerapu tikus disuntikkan isolat VNN secara intraperitonial
Hasil sentrifuse disaring menggunakan milipore
0‚45 µm dan dimasukkan kedalam microtube
Ikan dipelihara dan diamati hingga muncul gejala klinis serangan VNN
Organ- organ ikan yang terserang VNN diambil dan dibuat isolat yang lebih banyak untuk disimpan dalam
