BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.6 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT
2.6.2 Komponen KCKT
Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok yaitu: wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak (pompa), alat untuk memasukkan sampel (injektor), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase
gerak, tabung penghubung, dan suatu komputer atau integrator atau perekam Gambar ilustrasi dapat dilihat pada gambar 2.3 (Rohman, 2007).
Gambar 2.3 Sistem KCKT isokratik
2.6.2.1Wadah fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis (Rohman, 2007).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut (Rohman, 2007).
Menurut Johnson dan Stevenson (1991), fase gerak haruslah: a. Murni, tanpa cemaran.
b. Tidak bereaksi dengan kemasan. c. Sesuai dengan detektor.
d. Dapat melarutkan cuplikan. e. Mempunyai viskositas rendah.
f. Memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah, jika diperlukan.
g. Harganya wajar.
Menurut Putra (2007), elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu:
a. Sistem elusi isokratik: elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap.
b. Sistem elusi gradien: elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu.
2.6.2.2Pompa
Pompa terbuat dari bahan yang inert terhadap semua pelarut. Bahan yang umum digunakan adalah gelas baja antikarat dan teflon. Pompa yang digunakan mampu menghasilkan tekanan sampai 5000 psi. Aliran pelarut dari pompa harus tanpa denyut untuk menghindari hasil yang menyimpang dari berbagai detektor (Ditjen POM, 1995).
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada dua jenis pompa dalam KCKT yaitu: pompa dengan tekanan kostan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan (Rohman, 2007). Berdasarkan cara kerja pompa untuk KCKT dapat digolongkan dalam dua kelompok yaitu pompa kecepatan tetap dan pompa tekanan tetap. Masing-masing mempunyai kelebihan dan kelemahan dan tak satupun yang bisa dipakai secara menyeluruh (Munson, 1991).
2.6.2.3Injektor
Dua teknik untuk menyuntikkan analit ke dalam kolom yaitu dengan menyuntikkan analit kedalam arus yang mengalir dan injeksi waktu ”aliran berhenti”. Pada teknik aliran berhenti, aliran kolom dihentikan dan setelah tekanan pada tempat penyuntikan turun hingga nol, tempat penyuntikan dibuka dan analit disuntikkan. Tempat penyuntikan ditutup dan pompa dijalankan kembali (Ditjen POM, 1995).
Ada tiga tipe injektor yang dapat digunakan:
a. Hentikan aliran/stop flow: aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan. Teknik ini bisa digunakan karena difusi didalam aliran kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.
b. Septum: injektor-injektor langsung kealiran fase gerak umumnya sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Disamping itu,
partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Katup putaran (loop valve): tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari pada 10 µl dan sekarang digunakan dengan cara automatis (dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksi secara manual). Pada posisi LOAD, sampel loop (cuplikan dalam putaran) diisi pada tekanan atmosfer. Bila katup difungsikan, maka cuplikan didalam putaran akan bergerak ke dalam kolom (Putra, 2007).
2.6.2.4Kolom
Kolom yang digunakan untuk pemisahan analit umumya mempunyai diameter dalam yang kecil (2-4 mm), kolom yang berdiameter lebih besar digunakan untuk keperluan preparatif. Bahan pengisi kolom berupa partikel kecil (3-50 m) ataupun berukuran lebih kecil 3-10 m, hampir seluruhnya berpori. Ukuran partikel yang lebih kecil memberi pemisahan yang lebih efisien (Ditjen POM, 1995).
Menurut Edward dan Stevenson (1991), kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok:
a. Kolom analitik: garis tengah-dalam 2-6 mm. Panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk kemasan, untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm, untuk kemasan mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm.
b. Kolom preparatif: umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan panjang 25-100 cm.
2.6.2.5Fase Diam
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Oktadesil silika (ODS atau C18) merupaka fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran rendah, sedang, maupun tinggi (Rohman, 2007).
2.6.2.6Detektor
Detektor yang biasa digunakan dalam KCKT menurut Ditjen POM (1995), adalah:
- Fotometer ultraviolet, merupakan detektor yang umum dan stabil.
- Refraktometer diferensial, mendeteksi perbedaan indeks bias pelarut murni dan indeks bias pelarut zat yang diuji.
- Flourometer, detektor yang peka untuk senyawa yang dapat berflourosensi.
- Elektokimia.
Menurut Rohman (2007), idealnya suatu detektor harus mempunyai karakterisasi sebagi berikut:
- Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reproduksibel.
- Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.
- Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meninimalkan pelebaran pita.
- Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas.
- Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan aliran fase gerak.
2.6.2.7Komputer, Integrator, atau Rekorder
Alat pengumpul data seperti komputer, integrator, atau rekorder, dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh detektor lalu mem-plotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang analis (pengguna) (Rohman, 2007).
Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak-puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram.
W W1/2 H1/2 H Rt Area Gambar 2.4 Kromatogram
Hampir semua jenis campuran solut dapat dipisahkan dengan KCKT karena banyaknya fase diam yang tersedia dan selektifitas yang dapat ditingkatkan dengan mengatur fase gerak. Pemisahan dapat dilakukan dengan fase normal atau fase terbalik tergantung pada polaritas relatif fase diam dan fase gerak.