BAB I PENDAHULUAN
1.4. Manfaat 4
2.3.2. Komponen-Komponen Penting dari KCKT
Fase gerak dalam KCKT sudah tentu zat cair, dan untuk menggerakkannya melalui kolom diperlukan alat. Ada dua jenis utama pompa yang digunakan tekanan-tetap dan pendesakan-tekanan-tetap. Pompa pendesakan tekanan-tetap dapat dibagi lagi menjadi pompa torak dan pompa semprit. Pompa torak menghasilkan aliran yang berdenyut, jadi memerlukan peredam denyut atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis alas detector yang stabil jika detector peka terhadap aliran. Kelebihan utamanya adalah tandonnya tidak terbatas. Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak berdenyut, tetapi tandonnya terbatas.( Johnson,E.L dan Stevenson,R.1991)
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam.Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml/ menit. Untuk tujuan preparative, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 ml/ menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reproducible, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada dua jenis pompa dalam KCKT yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan
aliran fase gerak yang konstan.Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.(Rohman, 2007)
b.injektor
Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada dua ragam utama : aliran henti dan pelarut mengalir. Ada tiga jenis dasar injector, yaitu:
a) Aliran-henti: aliran dihentikan, penyuntikan dilakukan pada tekanan atmosfer; system ditutup, dan aliran dilanjutkan lagi (biasanya system aliran utama tetap berada pada tekanan kerja). Cara ini dipakai karena difusi di dalam zat cair kecil, jadi umumnya daya pisah tidak dipengaruhi.
b) Septum: ini adalah injector langsung pada aliran, yang sama dengan injector yang lazim dipakai pada kromatografi gas. Injektor tersebut dapat dipakai pada tekanan sampai sekitar 60-70 atmosfer. Sayang sekali, septum tidak dapat dipakai untuk semua pelarut KC. Selain itu, partikel kecil terlepas dari septum dan cendrung menyumbat.
c) Katup jalan-kitar : jenis injector ini, biasanya dipakai untuk menyuntikkan volum yang lebih besar dari 10 l dan sekarang dipakai dalam system yang diotomatkan.(volum yang lebih kecil dapat disuntikkan secara manual memakai adaptor khusus). Pada kedudukan mengisi, jalan-kitar cuplikan diisi pada tekanan atmosfer. Jika katup dijalankan (dibuka), cuplikan didalam jalan-kitar teralirkan ke dalam kolom.(Johnson,E.L dan Stevenson,R. 1991).
c. Kolom
Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
• Kolom analitik : garis tengah dalam 2-6 mm. Panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk kemasan felikel biasanya panjang kolom 50-100 cm, untuk kemasan mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm
• Kolom preparatif; umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dari panjang 25-100 cm.(Johnson,E.L dan Stevenson,R. 1991)
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
- Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10- 100 µl/ menit )
- Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spectrometer massa.
- Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.(Rohman, 2007)
d. Detektor
Detektor yang merupakan tulang punggung kromatograf cair kecepatan tinggi modern (KCKT) ialah detector UV 254 nm. Detektor UV-tampak dengan panjang gelombang yang berubah-ubah sekarang menjadi popular karena dapat dipakai untuk mendeteksi senyawa dalam lingkup lebih luas.(Johnson,E.L dan Stevenson,R. 1991)
Beberapa persyaratan detector adalah:
1. Sensitivitas yang sangat tinggi, dengan rentang sensitivitas 10-8 – 10-15 g per detik
2. Kestabilan dan reprodusibiliti yang sangat baik
3. Memberikan respon yang linier terhadap konsentrasi solute (linarut) 4. Dapat bekerja dari temperature kamar sampai 400oC
5. Tidak dipengaruhi perubahan temperature dan kecepatan pelarut pengembang 6. Mudah didapat dan mudah pemakaiannya oleh operator
7. Dapat selektif terhadap macam-macam linaurt didalam larutan pengembang 8. Tidak merusak sampel
9. Dapat menghilangkan “ zone broadening” dengan adanya pengaruh internal volume. (Mulja, 1995).
e. Elusi Landaian
Elusi landaian ialah peningkatan kekuatan fase gerak selama analisis kromatografi.Hasil elusi landaian ialah perpendekan waktu tambat senyawa yang ditahan dengan kuat dalam kolom.
Elusi landaian mempunyai beberapa keuntungan :
• Waktu analisis keseluruhan dapat dikurangi secara berarti
• Daya pisah keseluruhan per satuan waktu campuran ditingkatkan;
• Bentuk puncak diperbaiki (pembentukan ekor lebih kecil);
• Kepekaan efektif ditingkatkan karena bentuk puncak kurang beragam.
f. Fase Gerak
Pada kromatografi cair, susunan pelarut atau fase gerak merupakan salah satu peubah yang mempengaruhi pemisahan. Berbagai macam pelarut dipakai dalam semua ragam
KCKT, tetapi ada beberapa sifat yang diinginkan yan berlaku umum.Fase gerak haruslah:
a. Murni, tanpa cemaran;
b. Tidak bereaksi dengan kemasan; c. Sesuai dengan detector;
d. Dapat melarutkan cuplikan; e. Mempunyai viskositas rendah
f. Memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah, jika diperlukan; g. Harganya wajar.
Pada umumnya pelarut dibuang setelah dipakai karena tata kerja pemurnian memakan waktu dan mahal.(Johnson,E.L dan Stevenson,R. 1991).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.
Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.Untuk fase normal ( fase diam lebih polar daripada fase gerak ), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.Sementara untuk fase terbalik ( fase diam kurang polar daripada fase gerak ), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan methanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut-pelarut jenis alcohol.Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum disbanding dengan fase terbalik.(Rohman, 2007)
g .wadah fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing ( penghilangan gas )yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan detector sehingga akan mengacaukan analisis.Pada saat membuat pelarut untuk fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut, buffer, reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi, dan lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk KCKT berderajat KCKT ( HPLC grade ). Adanya pengotor dalam dapat terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut. Karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. (Rohman, 2007).
