HASIL DAN PEMBAHASAN
4.4 Konfirmasi pGEM-araA dengan Menggunakan Enzim Restriksi
Plasmid pGEM-araA hasil isolasi dikonfirmasi dengan pemotongan oleh enzim restriksi SmaI dan KpnI untuk mengetahui plasmid pGEM-T Easy membawa gen araA atau tidak, enzim restriksi yang sama juga digunakan untuk memotong plasmid ekspresi pBF yang akan digunakan. Pasangan primer yang dirancang dengan menambahkan situs pengenalan dari enzim restriksi SmaI dan KpnI menyebabkan gen araA yang diligasikan ke dalam plasmid pGEM-T Easy akan memiliki situs pemotongan dari kedua enzim tersebut.
Berdasarkan hasil visualisasi elektroforesis menunjukkan bahwa pemotongan pGEM-araA menggunakan dua jenis enzim restriksi yaitu SmaI dan KpnI telah
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 K
M 1 2 3 4 5 K 1500 bp
1518 bp A
B C
3000 bp 1000 bp
1518 bp
20
berhasil dilakukan dengan munculnya pita pada ukuran sekitar 3015 yang menunjukkan pita pGEM-T Easy dan pita pada ukuran sekitar 1518 bp yang menunjukkan pita gen araA (Gambar 4.5 lajur 5). Hasil pemotongan dengan satu enzim restriksi baik oleh SmaI ataupun KpnI juga menunjukkan pGEM-araA telah terpotong dengan munculnya ukuran pita pada ukuran sekitar 4533 bp (Gambar 4.5 lajur 6-7). Hasil dari pemotongan pGEM-araA menunjukkan bahwa gen araA telah berhasil dikloning.
Gambar 4.5 Hasil pemotongan pBF dan pGEM-araA dengan enzim restriksi (Ket:
1= pBF tidak dipotong dengan enzim, 2= pBF dipotong KpnI, 3= pBF dipotong SmaI, 4= pBF dipotong SmaI dan KpnI, M= marker, 5=
pGEM-araA dipotong SmaI dan KpnI, 6= pGEM-araA dipotong SmaI, 7= pGEM-araA dipotong KpnI, 8= pGEM-araA tidak dipotong (uncut) Plasmid pBF yang digunakan sebagai vektor ekspresi juga dikonfirmasi dengan pemotongan oleh enzim restriksi yang sama dengan yang memotong gen araA yaitu SmaI dan KpnI. Hasil pemotongan menghasilkan satu pita pada ukuran 6600 bp (Gambar 4.5 lajur 4). Sifat komplementer hasil restriksi dari enzim restriksi yang sama (yang menghasilkan ujung lancip yang sama) sangat penting untuk menempelkan DNA dari sumber yang berbeda. Penggunaan dua jenis enzim restriksi yang berbeda bertujuan untuk mencegah kesalahan arah orientasi penyisipan gen dan mencegah terjadinya ligasi antar kedua ujungnya sendiri (self-ligation).
Dalam kloning gen tahap yang penting adalah proses restriksi molekul DNA dan vektor dengan ukuran yang tepat. Vektor yang akan digunakan harus dipotong untuk membuka lingkaran karena bentuk dari vektor itu adalah sirkular sehingga molekul DNA yanga akan disisipkan dapat diinsersikan. Enzim restriksi akan mampu memotong molekul ganda DNA pada suatu pasangan sekuen nukleotida tertentu yang disebut situs restriksi (Russell, 1994).
1500 bp 3000 bp
1 2 3 4 M 5 6 7 8
4533 bp 6600 bp
21
4.5 Subkloning Gen araA ke Plasmid Ekspresi pBF
Subkloning adalah suatu teknik pemindahan fragmen DNA dari satu vektor ke vektor lain, dilakukan agar fragmen DNA dapat diekspresikan pada vektor (Brooker, 2005). Hasil proses transformasi hasil konstruksi plasmid ekspresi rekombinan pBF-araA ke E. coli DH5α dikonfirmasi dengan teknik PCR koloni.
Sebanyak 15 koloni yang di PCR dengan menyertakan kontrol positif araA hanya ada satu yang positif koloni, yang membawa plasmid rekombinan pBF-araA. Hal ini bisa disebabkan karena kemungkinan terjadi ligasi vektor tanpa insert atau ujung pemotongan vektor berikatan/ meyambung dengan ujung vektor lainnya.
Koloni yang positif membawa pBF-araA di streak (gores) pada media LB agar + ampisilin (100 mg/mL) yang tujuannya agar didapat semua koloni yang tumbuh adalah murni koloni yang membawa plasmid rekombinan pBF-araA. Hasil streak kemudian dilakukan skrining dengan memilih 10 koloni secara acak untuk di PCR koloni kembali dan hasil visualisasi dengan elektroforesis menunjukkan bahwa semua koloni yg dipilih adalah positif koloni dengan munculnya pita DNA pada ukuran sekitar 1518 bp (Gambar 4.6).
Gambar 4.6 Hasil PCR koloni dari hasil streak koloni positif pBF-araA (Ket:
M=marker, 1-10= koloni positif pBF-araA)
Selanjutnya dilakukan proses isolasi plasmid rekombinan pBF-araA dengan menumbuhkan positif koloni pada media LB cair + ampisilin. Konfirmasi hasil isolasi plasmid pBF-araA dilakukan dengan pemotongan oleh enzim restriksi SmaI dan KpnI.
Berdasarkan hasil visualisasi dengan elektroforesis pemotongan pBF-araA menggunakan dua enzim restriksi yaitu SmaI dan KpnI berhasil dilakukan dengan munculnya pita DNA pada ukuran sekitar 6600 yang menunjukkan pita plasmid pBF dan pita pada ukuran sekitar 1518 bp yang menunjukkan pita gen araA (Gambar 4.7 lajur 1). Hasil pemotongan dengan satu enzim restriksi baik oleh SmaI ataupun KpnI 3000 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1500 bp
22
juga menunjukkan pBF-araA telah berhasil terpotong dengan munculnya pita pada ukuran sekitar 8118 bp (Gambar 4.7 lajur 3-4).
Gambar 4.7 Hasil pemotongan pBF-araA dengan enzim restriksi (Ket: M= marker, 1= pBF-araA dipotong SmaI dan KpnI, 2= pBF-araA dipotong KpnI, 3=
pBF-araA dipotong SmaI, 4= pBF-araA tidak dipotong dengan SmaI dan KpnI (uncut)
Hasil dari pemotongan pBF-araA menunjukkan bahwa gen araA telah berhasil di subkloning ke plasmid ekspresi pBF. Hasil isolasi plasmid pBF-araA yang telah terkonfirmasi selanjutnya ditransformasikan ke dalam sel inang E. coli BL21(DE3). Hasil transformasi pBF-araA ke E. coli BL21(DE3) didapat sebanyak 22 koloni yang tumbuh pada cawan. Koloni yang tumbuh di PCR koloni untuk mengetahui keberhasilan proses transformasi. Sebanyak 10 koloni yang dipilih kemudian di PCR, hasilnya ialah semua koloni positif membawa plasmid rekombinan pBF-araA dengan munculnya pita pada ukuran 1518 bp (Gambar 4.8).
Gambar 4.8 Hasil PCR koloni transforman pBF araA ke E. coli BL-21 (DE3) (Ket:
M= marker, 1-10= koloni transforman, K= kontrol positif araA)
Sel inang E. coli BL21(DE3) digunakan untuk mengekspresikan plasmid rekombinan pBF-araA menjadi protein karena memiliki T7 RNA polymerase yang akan dikenali oleh promotor T7 pada vektor ekspresi pBF. T7 RNA polymerase
1500 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 K M 1 2 3 4
1500 bp 8000 bp 6000 bp
1518 bp 6600 bp
8118 bp
1518 bp 3000 bp
1000 bp
23
hanya spesifik pada E. coli BL21. Menurut Stratagene (2004), ekspresi protein rekombinan umumnya menggunakan sel inang E. coli BL21 karena mempunyai stabilitas dan kontrol yang tinggi dalam mengekspresikan protein. BL21 adalah salah satu strain E. coli yang mengandung lisogen lambda bakteriophage 21. Salah satu jenis E. coli BL21 ialah E. coli BL21 (DE3). Koloni positif yang membawa pBF-araA kemudian ditumbuhkan pada media LB cair + ampisilin untuk mengetahui ekspresi dari gen araA dan mengetahui berat molekulnya sebagai protein fusi dengan SDS-PAGE.
4.6 Ekspresi Gen araA
Proses ekspresi gen araA untuk menghasilkan enzim rekombinan L-arabinose isomerase dilakukan dengan penambahan IPTG untuk menginduksi ekspresi dari plasmid rekombinan pBF-araA. Mekanisme ekspresi gen asing dalam sel prokariot seperti E. coli dapat dilakukan melalui induksi isopropil-1-tio-β- galaktosidase (IPTG).
Hasil visualisasi dengan menggunakan SDS-PAGE menunjukkan bahwa pBF-araA dalam sel inang E. coli BL21(DE3) telah berhasil mengekspresikan enzim rekombinan L-arabinose isomerase dalam bentuk protein fusi dengan penambahan IPTG sebagai penginduksi ekspresi dari plasmid ekspresi rekombinan (Gambar 4.9).
Gambar 4.9 Hasil SDS-PAGE protein rekombinan pBF-araA dan pBF, A).
Penambahan IPTG, B). Tanpa penambahan IPTG (ket: M= marker, T= total protein, S= supernatan, P= pellet)
+ IPTG
24
Hasil SDS-PAGE menunjukkan adanya pita protein target dengan berat molekul ±100 kDa pada fraksi total protein (T) dan fraksi supernatan (S), yang menunjukkan bahwa enzim rekombinan L-arabinose isomerase telah berhasil terekspresi setelah penambahan IPTG dalam kondisi terlarut (Gambar 4.9.A).
Terlihatnya pita yang jelas dan tebal pada bagian supernatan menunjukkan bahwa protein target muncul dalam fraksi terlarut. Supernatan disebut juga dengan ekstrak enzim kasar (Crude Extract Enzyme). Sedangkan pada fraksi pellet terlihat adanya pita protein yang tipis. Hasil yang sama juga ditunjukkan dari hasil ekspresi dari His-BLA (pBF), yang menunjukkan adanya pita protein dengan berat molekul ± 45 kDa baik pada fraksi total protein (T) dan supernatan (S), dan pita yang tipis terlihat pada fraksi pellet. Berdasarkan penelitian Wibowo (2017), ekspresi protein rekombinan target L-arabinose isomerase (L-AI) pada sel inang E. coli BL21(DE3) menghasilkan protein dengan ukuran ±56 kDa.
Berdasarkan data ekspresi yang didapat, permasalahan ekspresi protein rekombinan target yang sebelumnya membentuk inclusion body dapat teratasi dengan teknik protein fusi, ditunjukkan dengan berhasilnya protein target terekspresi dalam fraksi terlarut sebagai protein fusi menggunakan plasmid ekspresi pBF yang dirancang untuk BLA- protein fusi. Serta, terbukti bahwa protein rekombinan yang sulit diekspresikan pada E. coli ketika protein diekspresikan sebagai protein fusi menjadi mudah larut dengan His-BLA, dan His-BLA adalah mitra yang sangat tepat untuk mengekspresikan protein rekombinan yang sulit untuk diekspresikan.
Plasmid pBF dipilih sebagai plasmid untuk mengekspresikan gen araA karena merupakan plasmid yang telah dirancang untuk BLA-fusi protein (Gambar 2.3).Teknik protein fusi adalah metode yang tepat untuk ekspresi protein heterolog dalam E. coli (Arnau et al. 2006; Esposito dan Chatterjee 2006; Waugh 2005).Mitra fusi dapat meningkatkan kelarutan dan efisiensi pelipatan protein target dalam konstruksi fusi. Fusi BLA merupakan strategi yang tepat dalam sistem ekspresi E.
coli untuk menghindari pembentukan inclusion body atau degradasi dari protein target rekombinan. Sifat yang sangat larut dan kemampuan melipat kembali yang efisien dapat memenuhi syarat His-BLA sebagai mitra protein fusi (Tokunaga et al.
2009).
25
BAB 5