TINJAUAN PUSTAKA
2.4 Senyawa Flavonoida
2.5.1 Kromatografi kertas (KKt)
Kromatografi kertas (KKt) pada hakekatnya adalah KLT pada lapisan tipis selulosa atau kertas. Metode ini merupakan jenis dari sistem partisi dimana fase gerak biasanya merupakan campuran dari satu atau lebih pelarut-pelarut organik dan air. Kertas yang digunakan pada percobaan awal adalah kertas Whatmann No. 1, sedangkan kertas Whatmann No. 3 biasanya digunakan untuk pemisahan pada jumlah yang lebih besar karena dapat menampung lebih banyak cuplikan (Markham, 1982).
Keuntungan utama KKt ialah kemudahan dan kesederhanaan pada pelaksanaan pemisahan, yaitu hanya pada lembaran kertas saring yang berlaku sebagai medium pemisahan. Senyawa pada KKt biasanya dideteksi sebagai bercak berwarna atau bercak berfluoresensi UV setelah direaksikan dengan penampak bercak (Harborne dkk., 1975). Keuntungan lain ialah jumlah flavonoida yang diperlukan untuk analisis sangat sedikit (biasanya skitar 0,1mg) (Markham, 1982).
Menurut Markham (1982), hal-hal yang perlu diperhatikan pada saat melakukan pemisahan secara KKt:
1. Metode pemisahan (penaikan, penurunan, atau mendatar).
2. Macam dari kertas.
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
17 3. Pemilihan dan pembuatan pelarut.
4. Kesetimbangan dalam bejana yang dipilih.
5. Pembuatan cuplikan.
6. Waktu pengembangan.
7. Metode deteksi dan identifikasi.
Gerakan noda suatu senyawa dalam pengembang tertentu disebut bilangan Rf senyawa dalam pengembang. Bilangan Rf didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh garis depan fase gerak (diukur dari garis awal), dimana jarak noda dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut. Karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0.
Pembanding bilangan Rf flavonoida yang belum dikenal dapat diidentifikasi dengan Rf yang telah dikenal dari jenis flavonoida tumbuhan lain dan sejenis dengan tumbuhan yang akan diidentifikasi merupakan cara yang berguna untuk membandingkan flavonoida yang sedang diidentifikasi dengan flavonoida yang tidak ada di laboratorium (Markham, 1982).
Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf adalah struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan, suhu, kesetimbangan, sifat dari penyerap, tebal dan kerataan lapisan penyerap, pelarut, kertas, sifat dari campuran, derajat kejenuhan dari bejana pengembangan, tekhnik percobaan dan jumlah cuplikan yang di guna- kan (Markham, 1982).
2.6 Spektrofotometri
Spektrofotometri sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
18
cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi panjang gelombang. Kelebihan spektrofotometer dengan fotometer adalah panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih dideteksi dan cara ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma, grating atau celah optis. Pada fotometer filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek pada panjang gelombang tertentu (Watson, 2005).
2.6.1 Spektrofotometri UV
Prinsip kerja spektrofotometer UV adalah interaksi yang terjadi antara energi yang berupa sinar monokromatis dari sumber sinar dengan materi berupa molekul. Besar energi yang diserap tertentu dan menyebabkan elektron tereksitasi dari keadaan dasar ke keadaan tereksitasi yang memiliki energi lebih tinggi.
Prinsip kerja spektrofotometer berdasarkan hukum Lambert Beer, yaitu bila cahaya monokromatik (Io) melalui media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It).
Penyerapan sejumlah energi, menghasilkan percepatan dari elektron dalam orbital tingkat dasar ke orbital yang berenergi lebih tinggi. Serapan yang kuat timbul bila transisi disertai dengan perubahan besar di dalam momen transisi (Silverstein dkk., 2005).
Spektrum flavonoida biasanya ditentukan dalam larutan dengan pelarut Metanol (MeOH) atau Etanol (EtOH). Spektrum khas terdiri atas dua maksimal pada rentang 240-285 nm (pita II) dan 300-400 nm (pita I). Kedudukan yang tepat dan kekuatan nisbi maksimal tersebut memberikan informasi yang berharga mengenai sifat flavonoida dan pola oksigennya. Ciri khas spektrum tersebut ialah kekuatan nisbi yang rendah pada pita I dalam dihidroflavon, dihidroflavonol, dan
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
19
isoflavon serta kedudukan pita I pada spektrum khalkon, auron dan antosianin yang terdapat pada panjang gelombang yang tinggi (Markham, 1982). Pada umumnya serapan pada pita II dapat dianggap berasal dari sitem benzoil cincin A dan pita I dari sistem sinamoil cincin B (Harbone dkk., 1975).
Gambar 2.11 Sistem sinamoil dan benzoil (Harborne dkk., 1975).
2.6.2 Spektrofotometri IR
Spektrum infra merah suatu molekul adalah hasil transisi antara tingkat energi getaran yang berlainan. Pancaran inframerah yang kerapatannya kurang dari 100 cm-1 (panjang gelombang lebih daripada 100 μm) diserap oleh sebuah molekul organik dan diubah menjadi putaran energi molekul. Penyerapan ini tercantum, namun spektrum getaran terlihat bukan sebagai garis-garis melainkan berupa pita-pita. Hal ini disebabkan perubahan energi getaran tunggal selalu disertai disertai sejumlah perubahan energi putaran. Letak pita di spektrum inframerah dalam bilangan gelombang (Silverstein dkk., 2005).
Pada prinsipnya, bila radiasi inframerah dilewatkan melalui suatu cupli- kan, maka molekul-molekulnya dapat menyerap energi sehingga terjadi transisi antara vibrasi dasar dan tingkat vibrasi tereksitasi. Pengabsorbsian energi pada berbagai frekuensi dapat dideteksi oleh spektrofotometer inframerah, yang memplot jumlah radiasi inframerah yang diteruskan melalui suatu cupikan sebagai fungsi frekuensi atau panjang gelombang radiasi. Plot disebut spektrum inframerah yang memberikan gugus fungsional (Silverstein dkk., 2005).
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
20
Pada temperatur di atas temperatur nol absolut, semua atom di dalam molekul bervibrasi antara satu dengan yang lain. Ketika frekuensi dari vibrasi spesifik sama dengan frekuensi dari radiasi inframerah yang mengenai langsung pada molekul, molekul tersebut akan menyerap radiasi. Setiap molekul mempunyai derajat kebebasan sebesar jumlah derajat kebebasan atom-atomnya.
Setiap atom di dalam koordinat cartesius mempunyai tiga derajat kebebasan yag menyatakan kedudukan relatifnya terhadap atom-atom lainnya di dalam molekul.
Syarat suatu gugus fungsi dalam suatu senyawa dapat terukur pada spektra IR adalah adanya perbedaan momen dipol pada gugus tersebut. Vibrasi ikatan akan menimbulkan fluktuasi momen dipol yang menghasilkan gelombang listrik (Stuart, 2004).
Untuk pengukuran menggunakan IR biasanya pada daerah bilangan gelombang 400-4500 cm-1. Daerah pada bilangan gelombang ini disebut daerah IR sedang, dan merupakan daerah optimum untuk penyerapan sinar IR bagi ikatan-ikatan dalam seyawa organik. Suatu ikatan kimia dapat bervibrasi sesuai dengan level energinya sehingga memberikan level yang spesifik. Hal inilah yang menjadi dasar pengukuran spektroskopi inframerah. Jenis-jenis vibrasi molekul biasanya terdiri dari enam macam, yaitu symmetrical stretching, assymmetrical stretching, scissoring, rocking, wagging, dan twisting. Daerah inframerah dibagi
menjadi tiga sub daerah, yaitu inframerah dekat (14000-4000 cm-1), inframerah sedang (4000-400 cm-1), dan inframerah jauh (400-10 cm-1) (Stuart, 2004).