3. METODE PENELITIAN
3.6. Analisis Kadar Diazinon
3.6.1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi Lapis Tipis adalah metode pemisahan fisikokimia yang lapisan pemisahan terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam) dan ditempatkan pada penyangga berupa plat gelas logam atau lapisan yang cocok, campuran yang akan dipisahkan berupa larutan. Larutan ditotolkan berupa bercak, kemudian plat diletakkan dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak) yang telah dijenuhkan. Pemisahan terjadi selama perambatan fase gerak. Derajat retensi pada KLT dinyatakan sebagai “Retention Factor” (Rf) yang dinyatakan dengan rumus sebagai berikut:
Jarak titik pusat bercak dari titik awal
Rf = ……….(1)
Metode ini dilakukan dengan maksud untuk mengetahui adanya atau tidaknya produk turunan hasil degradasi diazinon dalam sampel. Analisis kadar diazinon dengan metode KLT ini menggunakan plat silika gel 60 F254, eluen pengembang heksana:etilasetat dengan perbandingan 10:1 (v/v) dan pewarna digunakan serium (II) sulfat.
KLT dilakukan dengan cara mentotolkan sampel pada plat kemudian dimasukkan kedalam bejana yang berisi heksana dan etyl asetat dengan perbandingan 10:1 (v/v) yang telah dijenuhkan selama 30 menit. Lalu didiamkan hingga eluen naik sampai batas garis. Spot yang terbentuk dapat dilihat dengan menggunakan sinar ultraviolet dan pewarnaan dengan menggunakan serium (II) sulfat.
3.6.2. Spektrofotometer UV-VIS
Spektrofotometri adalah suatu metode pengukuran serapan radiasi elektromegnetik pada panjang gelombang tertentu yang sempit dan mendekati monokromatik dan diserap oleh zat. Pelarut yang sering digunakan adalah air, metanol, n-heksana, etanol, minyak bumi, dan eter.
Analisis diazinon dengan metode spektrofometri ini merupakan modifikasi yang dilakukan oleh Bavcon et al. (2003) dengan metode yang dilakukan oleh Ningsih (2001), yaitu dilakukan dengan cara mengekstraksi sebanyak 10 gram sampel dengan etil asetat sebanyak 20 ml. Larutan yang diperoleh diuapkan kemudian dilarutkan kembali dengan 2 ml metanol p.a, sampel disonifikasi agar larutan tersebut tercampur dengan baik (homogen). Kemudian dilakukan pembacaan pada spektrofotometer UV-VIS (Beckman DU 650) dengan sinar UV pada panjang gelombang 241 nm. Absorbansi yang diperoleh kemudian diplot pada kurva standar untuk menghitung konsentrasi diazinon dalam sampel.
3.7. Isolasi Mikroba dan Identifikasi bakteri
3.7.1. Pembuatan Media
3.7.1.1. Potato Dekstrose Agar (PDA).
Cara pembuatan:
1. Ditimbang PDA sebanyak 3.9 g dan agar powder 0.5 g.
2. Kedua bahan tersebut dicampur dan ditambahkan dengan aquadest sebanyak 100 ml, kemudian dipanaskan sambil diaduk.
3. Setelah mendidih dan homogen media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit.
4. Media didinginkan (hangat kuku) lalu ditambahkan khloramphenikol 50 ppm sebanyak 1 ml yang telah disterilkan dengan millipore 0.45 μm. 5. Media dituang ke dalam petri steril ± 1-2 ml, dan didinginkan
6. Setelah padat petri ditutup dan dibalik agar uap air tidak jatuh ke atas permukaan agar.
3.7.1.2. Nutrien Agar (NA)
Media ini digunakan untuk menginokulasi bakteri dari SMC. Cara pembuatan:
1. Ditimbang NA sebanyak 2.3 g dan agar powder 0.5 g.
2. Kedua bahan tersebut dicampur dan ditambahkan dengan aquadest sebanyak 100 ml, kemudian dipanaskan sambil diaduk.
3. Setelah mendidih dan homogen media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit.
4. Media didinginkan (hangat kuku) lalu ditambahkan nistatyn 50 ppm sebanyak 1 ml yang telah disterilkan dengan millipore 0.45 μm.
5. Media dituang ke dalam petri steril ± 1-2 ml, dan didinginkan
6. Setelah padat petri ditutup dan dibalik agar uap air tidak jatuh ke atas permukaan agar.
3.7.2. Isolasi Mikroba (Bakteri dan Kapang)
Mikroba yang terdapat dalam SMC masih merupakan koloni campuran sehingga perlu dilakukan isolasi untuk mendapatkan isolat/biakan murni (koloni tunggal). Isolasi mikroba dapat dilakukan dengan dua cara yaitu
:
1. Metode Cawan Tuang/Taburan (Puor Plate Method)
Metode ini dilakukan dengan cara menggoreskan suspensi bahan yang mengandung bakteri pada permukaan medium agar yang sesuai dalam cawan petri. Setelah diinkubasi pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni yang terpisah yang mungkin berasal dari satu sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut. Metode goresan ini dapat dilakukan dengan metode goresan lurus, kuadran, atau radian.
2. Metode Cawan Gores (Streak Plate Method)
Metode dilakukan dengan cara menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada temperatur 50oC dengan suspensi bahan yang mengandung bakteri dan menuangkannya ke dalam cawan petri, setelah diinkubasi akan terlihat koloni- koloni yang tersebar di permukaan agar.
Dalam penelitian ini isolasi mikroba dilakukan dengan metode cawan tuang/gores yaitu dengan menginokulasi SMC pada media padat Nutrient Agar (NA) dan Potato Dekstrose Agar (PDA). Pada media padat NA ditambahkan zat antibiotik nistatyn yang berfungsi untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme kapang dan khamir sedangkan pada media padat PDA ditambahkan dengan khloramphenikol untuk menghambat pertumbuhan bakteri. Inokulasi mikroba ini dilakukan dengan dua metode yaitu cair dan padat:
1. Menimbang SMC sebanyak 1gram lalu di larutkan dengan air steril sebanyak 10 ml kemudian di goyang (shaker) selama 30 menit, supernatan yang diperoleh dipipet sebanyak 100 μl lalu dituang kedalam cawan petri yang berisi media PDA dan NA
2. Ditimbang kompos sebanyak 5 gram lalu ditabur kedalam cawan petri yang yang berisi media PDA dan NA.
Masing-masing cawan petri diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu kamar selama 24-48 jam. Bakteri dan kapang yang tumbuh dipindahkan pada media padat lain untuk memperoleh biakan murni. Setelah 2-3 hari isolat yang tumbuh pada media awal dipindahkan dan dipisahkan berdasarkan perbedaan bentuk dan morfologinya ke media padat NA dan PDA lainnya yang tidak
mengandung nistatyn dan khloramphenikol. Isolat-isolat tersebut dipindahkan dengan menggunakan jarum ose kemudian menggoreskannya pada media padat untuk memisahkan isolat-isolat tersebut agar diperoleh koloni tunggal (single coloni). Koloni tersebut diinkubasi selama 3 hari pada suhu ruang. Hal ini dilakukan berulang-ulang hingga diperoleh isolat yang murni. Isolat yang telah murni dipindahkan ke dalam media agar miring (NA dan PDA) dengan cara membuat garis zig zag. Kemudian diinkubasi selama 3 hari pada suhu ruang lalu disimpan dalam lemari pendingin.
3.7.3. Pewarnaan bakteri
Pewarnaan bakteri dimaksudkan untuk melihat struktur sel bakteri dengan seksama. Fungsi pewarnaan bakteri terutama memberi warna pada sel dan bagian-bagiannya agar lebih kontras dan tampak lebih jelas, sehingga dapat diamati berbagai bentuk (morfologi), jenis (gram positif atau gram negatif), susunan bakteri, serta sel-sel bakteri (spora, kapsel, atau flagela). Sel-sel bakteri yang tidak diwarnai pada umumnya sukar diamati dengan mikroskop cahaya biasa, karena sitoplasma sel mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya (Lay 1992). Hasil pewarnaan sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu:
a. Fiksasi, sebelum bakteri diwarnai terlebih dahulu dilakukan fiksasi dengan menggunakan cara fisik (pemanasan atau dengan freeze drying) ataupun menggunakan agen kimia (asam pikrat, alkohol, aseton, asam kromat-asam osmiat). Fiksasi berfungsi untuk (1) Mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel; (2) Mempertinggi sifat reaktif gugusan-gugusan karboksilat, amino primer, sulfihidril; (3) Merubah afinitas pewarna bakteri; (4) Mencegah terjadinya otolisis sel; (5) Dapat membunuh bakteri secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan-perubahan bentuk atau strukturnya; (6) Melekatkan bakteri di atas gelas benda; (7) Membuat sel lebih kuat (keras).
b. Substrat, tiap pewarna asam maupun basa dapat bereaksi dengan konstituen sel. Oleh karena itu substrat organik (lipid, protein, asam nukleat, dan karbohidrat) akan mempengaruhi pewarnaan bakteri. Sehingga dapat dibedakan sel-sel yang (1) basofil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat pewarna
bakteri basa; (2) asidofil atau oksifil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat pewarna bakteri asam; (3) sudanolfil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat pewarna bakteri yang dapat larut dalam minyak.
c. Intensifikasi Pewarnaan, dilakukan dengan mempertinggi kadar pewarna, temperatur pewarnaan (60-90 oC) atau menambah suatu mordan.
d. Pelunturan pewarna bakteri (Decolorizer), digunakan untuk mendapatkan kontras yang baik pada bayangan mikroskop.
Beberapa cara pewarnaan bakteri yang biasa dilakukan ialah pewarnaan sederhana, pewarnaan deferensial, pewarnaan Gram, pewarnaan Ziehl Neelsen (acid fast), dan pewarnaan negatif (Lay 1992). Pada penelitian ini dilakukan pewarnaan bakteri dengan menggunakan metode pewarnaan Gram. Pewarnaan gram meliputi 4 tingkatan yaitu:
1. Pemberian pewarna utama (larutan pewarna kristal violet, warna ungu) 2. Pengintensifan pewarna utama dengan menambahkan larutan mordan (JKJ) 3. Pencucian (dekolorisasi) dengan alkohol 70%
4. Pemberian pewarna penutup (pewarna lawan, counterstain) larutan pewarna safranin yang berwarna merah.
Dengan pewarnaan Gram maka dapat dibedakan bakteri yang bersifat positif dan bersifat negatif: (1) Bakteri Gram positif ialah bakteri yang mengikat pewarna utama dengan kuat sehingga tidak dapat dilunturkan dan diwarnai oleh pewarna lawan. Dengan menggunakan mikroskop sel-sel bakteri ini tampak berwarna violet; (2) Bakteri Gram negatif ialah bakteri yang daya ikat terhadap pewarna utama tidak kuat, sehingga dapat dilunturkan dan diwarnai oleh pewarna lawan. Dengan pengamatan mikroskopik sel bakteri ini tampak berwarna merah. Sifat Gram terutama ditentukan oleh sifat-sifat fisik dan kimia dinding sel dan membran sitoplasma. Dinding sel dan membran sitoplasma bakteri Gram positif mempunyai afinitas yang besar terhadap kompleks pewarna kristal violet dan iodium, sedang pada Gram negatif tidak. Pada waktu pewarnaan, larutan kristal violet dan iodium menembus sel bakteri. Pada sel bakteri Gram positif zat- zat ini membentuk senyawa yang sukar larut, tidak larut dalam peluntur, dan tidak diwarnai oleh pewarna penutup sedang bakteri Gram negatif tidak demikian.
Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara :
1. Gelas objek dibersihkan dengan alkohol 70%, lalu dipanggang di atas nyala api dan dinginkan
2. Biakan diambil dengan ose secara aseptik ke atas gelas objek, diratakan dan dikering-anginkan
3. Preparat yang telah kering difiksasi dengan cara melewatkan di atas api
4. Pada preparat diteteskan pewarna utama (Gram A) 1-2 tetes, dibiarka 1 menit lalu dicuci dan dikeringkan
5. Lalu ditetesi dengan larutan mordan Lugol (Gram B) dibiarkan 1 menit, dicuci dan dikeringkan
6. Kemudian dicuci dengan larutan peluntur (Gram C) selama 30 detik, dicuci dan dikeringkan
7. Lalu diberi larutan pewarna penutup (Gram D) dibiarkan 2 menit lalu dicuci dan dikeringkan
8. pengamatan dengan mikroskop dengan pembesaran 100 kali. Bakteri Gram positif berwarna violet dan Gram negatif berwarna merah.
3.7.4. Determinasi dan Identifikasi Bakteri
Untuk identifikasi dan determinasi suatu biakan murni dari hasil isolasi, perlu diamati morfologi koloni serta morfologi individual, sifat-sifat pewarnaan, sifat fisiologis (biokimia), patonogenesitas dan serologinya. Pada identifikasi bakteri yang pertama-tama harus dilakukan adalah pengamatan terhadap morfologi individual dan pertumbuhannya pada bermacam-macam media. Karena bakteri tidak dapat dideterminasi hanya berdasarkan sifat-sifat morfologinya saja tapi perlu pula diteliti sifat-sifat biokimia dan faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhannya (media, pH, dan temperatur). Pada pengujian untuk identifikasi bakteri digunakan pedoman Bergey’s Manual of Determinative Bakteriology (Holt et al. 1994 ).
Sifat Morfologi Bakteri:
1. Morfologi sel individual meliputi: ♦Ukuran, bentuk, dan rangkaian sel
♦Ada tidaknya spora, dan kedudukan spora
♦Ada tidaknya flagela, kedudukan, dan jumlah flagela ♦Ada tidaknya kapsula
♦Reaksi-reaksi pengecatan (pewarnaan)
2. Morfologi koloni meliputi bentuk, ukuran, tekstur, warna koloni, tipe medium.
Sifat Biokimia Bakteri:
Pengujian sifat biokimia bakteri meliputi:
1.Perubahan karbohidrat (daya fermentasi terhadap zat-zat gula dan hidrolisis terhadap pati)
2.Hidrolisis lemak (bakteri dapat menghidrolisis lemak menjadi gliserol dan asam lemak)
3.Penguraian protein (tiap-tiap spesies bakteri mempunyai daya hidrolisis dan penguraian protein yang berbeda-beda)
4.Reduksi bermacam-macam unsur (bakteri anaerob dapat mereduksi garam nitrat menjadi nitrit atau amonia, metilen blue atau indikator direduksi menjadi tidak berwarna. Bakteri bersifat aerob obligat dapat mereduksi H2O2 menjadi H2O dan O2)
5.Pembentukan figmen (pigmen akan tampak bila ada O2 bebas/aerob, dan dalam keadaan anaerob pigmen akan hilang)
6.Pengujian biokimia khusus lainnya.
Tahapan identifikasi bakteri adalah sebagai berikut:
1. Isolat bakteri yang akan diuji dibiakkan pada media cair dan dilanjutkan dengan media agar padat, setelah pertumbuhan lengkap sesuai lamanya inkubasi biakan pada suhu ruang (30-37 oC) bahkan pada suhu thermofilik hingga 50 oC, selanjutnya diamati morfologi koloninya. Pada tahap ini dilakukan dengan mengamati kultur biakan dan koloni yang tumbuh pada permukaan agar (kasar, halus) serta besarnya koloni (mm). kemudian dilakukan pengamatan morfologi pada Media Khusus Gram Negatif (Mac Conkey Agar). Selain menggunakan media tersebut diatas juga dapat menggunakan media selektive artinya bakteri
yang akan diamati akan tumbuh pada media khusus (SS agar, XLD agar, BRC).
1. Tes Katalase (Catalase Test)
Menggunakan H2O2 3% dengan cara meneteskan larutan tersebut pada permukaan objek glass, biakan murni diambil dengan ose lalu disentuhkan pada tetesan tersebut, bila dalam hitungan detik terdapat gelembung udara menandakan catalase positive.
2. Tes Oksidase (Oxidase Test)
Menggunakan NNNN-tetramethyl-p-phenylene diamine dihydrocloride (C6H4[N(CH3)2]22HCl) dicamper dengan asam askorbat (ascorbic acid), larutan tersebut diteteskan pada kertas saring. Biakan murni diambil dengan ose lalu digoreskan pada kertas saring tersebut. Bila dalam beberapa detik terjadi perubahan warna biru/violet menandakan Oxidase positive
3. Motility-Slide
a. Biakan yang tumbuh pada media cair/broth diambil dengan ose dan diletakkan pada cover glass, object glass. Pergerakan positif terlihat bergerak dan berlarian dengan cepat sedang yang negatif hanya bergerak dan diam ditempat.
b. Metode kedua yaitu menggunakan agar setengah padat yang ditempatkan pada tabung. Kultur diambil lalu ditusukkan pada media dari atas ke bawah. Setelah diinkubasi selama 24 jam terlihat penyebaran ke arah menyamping seperti warna keruh berarti menandakan positif.
4. Indole
Indol merupakan zat yang berbau busuk yang dihasilkan oleh bakteri yang ditumbuhkan dalam medium yang mengandung asam amino triptofan. Uji indol dengan menggunakan pepton cair pada tabung dengan bantuan pereaksi reagent kovac’s akan terlihat warna merah.
5. Methyl Red-Voger Proskaur (MRVP)
Pengujian ini dapat dilihat pada media methyl red pada tabung berwarna bening teh, kultur terlebih dahulu dibiakkan semalam setelah terjadi kekeruhan ditambahkan reagen methyl red 50-100 μL. Reaksi positif bila berwarna merah dan negatif bila berwarna kuning. Sedang untuk pengujian Vorges Proskaur
(VP) ke dalam media yang sama ditambahkan α-naphtol sebanyak 500-600 μL lalu dikocok dan ditambahkan KOH 40% sebanyak 200 μL. Reaksi dapat dilihat setelah 20-30 menit berwarna merah jika positif VP.
6. Citrate
Menggunakan media agar miring pada tabung yang berwarna hijau ditambahkan bromthymol blue. Biakan digereskan pada permukaan agar lalu diinkubasi 24-72 jam, perubahan warna menjadi biru jika positif. Untuk yang negatif di reinkubasi beberapa hari hingga terjadi perubahan.
7. Nitrate Reaction
Menggunakan nutrien broth yang ditambahkan KNO3. Biakan murni ditumbuhkan selama semalam setelah keruh menandakan cukup pertumbuhan dengan menambahkan reagen Nitrate soln A dan soln B terjadi perubahan warna menjadi merah terang.
Setelah pengujian di atas, dilakukan pengujian secara biokimia dengan menggunakan berbagai macam uji gula-gula dengan menggunakan medium Pepton water sebagai dasar medium digunakan Pepton 10 g, NaCl 5g, dan aquadest 1000 ml lalu ditambahkan indikator phenol red (pH 7.2-7.4) kemudian disterilisasi pada 115 oC selama 20 menit. Penambahan gula-gula seperti Aesculine, Arabinoce, Dulcitol, Fructose, Galactose, Inisitol, Lactose, Maltose, Rafinose, Rhamnose, Salicin, Sorbitol, Sucrose, Trehalose, Xylose dengan masing-masing konsentrasi antara 0.5-1%. Setelah penambahan gula-gula dilakukan sterilisasi dengan steam selama 10 menit. Perubahan warna menjadi kuning bila positif. Secara keseluruhan tahapan proses isolasi mikroba dan determinasi/identifikasi bakteri seperti ditunjukkan pada Gambar 4.
Gambar 4 Tahapan isolasi dan identifikasi bakteri
3.7.5. Uji Kemampuan Degradasi Diazinon
Mikroorganisme dapat mendegradasi pestisida apabila mikroorganisme tersebut diadaptasikan terlebih dahulu dengan lingkungan yang mengandung pestisida. Karena dalam proses adaptasi tersebut terjadi sintesis enzim yang dibutuhkan unuk mendegradasi senyawa-senyawa rekalsitran (Gumbira-Said dan Fauzi 1995).
Persiapan Sampel
Pembuatan Media (PDA & NA)
Pembiakan (inokulasi) mikroba
Pembiakan Bakteri dalam media NA Pembiakan Kapang/Khamir dalam media PDA
Isolasi Bakteri Isolasi
Kapang/Khamir
Determinasi/identifikasi bakteri
Pewarnaan bakteri
Uji sifat Biokimia
Koloni tunggal Koloni tunggal
Bakteri yang diperoleh dari hasil identifikasi lalu diujikan pertumbuhannya. Media pertumbuhan dan adaptasi yang digunakan adalah Nutrient Agar (NA) padat yang mengandung 100 dan 500 ppm diazinon.
Bakteri yang tumbuh kemudian dilakukan uji pembentukan zona jernih untuk menguji kemampuannya dalam mendegradasi diazinon. Media yang digunakan adalah media MSPY (Mineral Salt Pepton Yeast) yang mengandung diazinon 1000 ppm, 1500 ppm, dan 1700 ppm. Bakteri tersebut diinokulasi selama empat hari untuk melihat aktivitasnya dalam mendegradasi diazinon.
3.7.5.1. Pembuatan Media NA adaptasi.
Cara pembuatan media ini yakni dengan menimbang NA sebanyak 2.3 g dan agar powder 0.5 g ke dalam 100 ml air destilata kemudian dipanaskan sambil diaduk. Setelah mendidih dan homogen media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit. Kemudian media didinginkan (hangat kuku) lalu ditambahkan diazinon 100 dan 500 ppm lalu dituang ke dalam petri steril. Setelah padat petri ditutup dan dibalik agar uap air tidak jatuh ke atas permukaan agar. Kemudian bakteri diinokulasikan dan diinkubasi pada suhu 30 oC selama 3 hari.
3.7.5.2. Pembuatan Media MSPY.
Pembuatan media MSPY dilakukan dengan cara melarutkan KH2PO4 0.2 g, K2HPO4 0.5 g, MgSO4.7H2O 0.2 g, NaCl 0.2 g, CaCl2.2H2O 0.05 g, FeSO4.7H2O 0.025 g, Na2MoO4, 0.005 g, MnSO4 0.0005 g, NaWo2 0.0005 g, Bakto peptone 1.0 g, dan Yeast extract 2.0 g, ke dalam gelas piala yang berisi 1 liter air destilata kemudian diaduk sambil mengatur pH pada kisaran 7.0 (pH netral). Lalu larutan media dipindahkan ke dalam erlenmeyer yang berukuran 1 liter dan diisi bacto agar sebanyak 15 g, kemudian disterilkan dalam autoklaf (Oshiro 1996). Media steril tersebut kemudian ditambahkan diazinon dengan konsentrasi masing- masing, 1000 ppm, 1500 ppm, dan 1700 pm.
Menurut Margot dan Stammbach (1964), bahwa diazinon menguap pada suhu 83-84 oC, sensitif terhadap oksidasi pada suhu di atas 100 oC dan terdegradasi pada di atas 120 oC sehingga diazinon tidak dapat disterilkan dengan
autoklaf. Oleh karena itu diazinon harus disterilkan melalui proses sterilisasi penyaringan yakni dengan menggunakan filter ukuran 0.45 μm (millipore).
3.8. Analisis Aktivitas Mikroba dengan Fluorescein Diacetate (FDA) Assay Analisis aktivitas mikroba dilakukan dengan menggunakan metode seperti yang dilakukan oleh Eggen (1999), yaitu menggunakan Fluorescein Diacetate (FDA) Assay. FDA tidak digunakan untuk menghitung biomassa mikrobial tetapi untuk membandingkan aktivitas mikroba hydrolitik dalam satu ekosistem yang sama. Penentuan FDA dilakukan dengan cara menginkubasi sampel dalam larutan buffer, yang bertindak sebagai penerima elektron yang menurunkan warna fluorescein. Intensitas warna ditentukan dengan menggunakan spektofotometri.
Larutan standar FDA dibuat dengan melarutkan 0.0399 gram FDA ke dalam 100 mL aseton. Kemudian ditimbang 10 gram kompos ke dalam erlenmeyer yang telah diisi dengan larutan standar FDA masing-masing 0, 0.1; 0.2, 0.3, 0.5, 1.0 dan 1.5 mL, masing-masing erlenmeyer ditambah 50 mL buffer fosfat. Larutan standar diinkubasi dengan penggoyangan (rotary shaker) pada kecepatan 120 rpm selama satu jam kemudian ditambahkan 50 mL aseton untuk menghentikan reaksi hidrolisis. Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit, lalu disaring. Absorban filtrat diukur dengan spektrofotometri UV-VIS (Beckman DU 650) pada panjang gelombang (λ) 490 nm.
Perlakuan pada sampel dilakukan dengan cara menimbang FDA 0.200 gram lalu dilarutkan dengan aseton kemudian ditambah dangan “deionized water” (aquabidest) hingga 100 mL sebagai larutan stok. Sampel di timbang masing- masing 10 gram ke dalam erlenmeyer lalu ditambah 50 ml buffer fosfat (pH 7.6) dan larutan FDA 0.5 mL kemudian diinkubasi dengan rotary shaker pada kecepatan 120 rpm selama satu jam kemudian ditambahkan 50 mL aseton. Larutan didekantasi (pindahkan) ke dalam tabung sentrifugasi dan disetrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit, lalu disaring dengan millipore (0.45 μm). Absorban diukur dengan spektrofotometri pada panjang gelombang (λ) 490 nm.
3.9. Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan ini dilakukan dengan menggunakan dua faktor yaitu konsentrasi diazinon (x1) dan perbandingan tanah dengan kompos (x2). Pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode permukaan respon (Respons Surface Method/RSM) mengikuti Rancangan Komposit Fraksional, masing-masing peubah uji terdiri dari tiga taraf dengan rincian seperti ditunjukkan pada Tabel 4.
Tabel 4 Kisaran dan taraf peubah uji pada optimasi bioremediasi
Jenis Perlakuan Nilai faktor terendah Nilai faktor tengah Nilai faktor tertinggi (-1) 0 (+1) Konsentrasi diazinon (ppm) 500 1000 1500 Rasio kompos dalam tanah (%) 10 20 30
Dalam penelitian ini digunakan Central Composite Design (CCD) (Montgomery,1991) dengan 3 ulangan pada titik pusat sehingga memenuhi model kuadratik, nilai pusat perlakuan digunakan konsentrasi diazinon 1000 ppm dan rasio kompos dalam tanah 20%. Matriks satuan-satuan percobaan pada proses bioremediasi dalam unit dan nilai asli seperti disajikan pada Tabel 5. Dimana nilai asli diperoleh dengan rumus
Tabel 5 Matriks satuan percobaan pada optimasi proses bioremediasi rancangan komposit fraksional
No
Kode Nilai asli
Keterangan Diazinon Kompos Diazinon
(ppm) Kompos(%) 1 1 1 1500 30 P1 2 -1 1 500 30 P2 3 1 -1 1500 10 P3. 4 -1 -1 500 10 P4 5 0 0 1000 20 P51 6 0 0 1000 20 P52 7 0 0 1000 20 P53 8 1.414 0 1707 20 P6 9 -1.41 0 293 20 P7 10 0 1.414 1000 35 P8 11 0 -1.414 1000 6 P9 12 - - 1000 0 K1 13 - - 1000 0 K2
Dengan dua peubah uji tersebut maka model kuadratiknya seperti bentuk persamaan berikut:
Yi = bo + b1x1i + b2x2i + b11x1i2 +b22x2i2 +b12x1i + ri ……….……….. (3)
Keterangan:
Y = Respon dari masing-masing perlakuan
X = (x1: konsentrasi diazinon; x2: rasio kompos dalam tanah) b = Koefisien parameter
r = error
Parameter respon utama yang digunakan adalah penurunan konsentrasi diazinon. Sebagai kontrol digunakan tanah tidak disterilisasi dan tanpa penambahan kompos (K1), dan tanah disterilisasi tanpa kompos (K2) dengan masing-masing konsentrasi diazinon 1000 ppm.
1 2 3 4
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Analisis Diazinon
4.1.1. Analisis Degradasi Diazinon dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Untuk memastikan ada atau tidaknya senyawa turunan hasil degradasi diazinon oleh aktivitas mikroba yang berasal dari SMC maka dilakukan analisis diazinon dengan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Hasil analisis dengan KLT dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5 Kromatogram hasil KLT dengan eluen heksana : etyl asetat (10:1, v/v) (1) diazinon teknis pekat; (2) stok diazinon 10000 ppm;
(3) sampel P5 (H14); (4) sampel P5 (Ho)
Dari Gambar 5 secara kualitatif terlihat bahwa diazinon teknis pekat (1) dan stok diazinon 1000 ppm (2) terdapat satu spot berwarna merah muda dengan masing-masing nilai Rf 0.28 dan 0.24 dan satu spot berwarna kuning kemungkinan merupakan pelarut dari senyawa diazinon tersebut. Pada sampel hari ke-14 (3) ada tujuh spot dan satu diantaranya berwarna merah muda dan pada hari ke-0 (4) ada tiga spot dengan masing-masing nilai Rf 0.24 dan 0.28 sama dengan stok diazinon 1000 ppm dan diazinon teknis pekat, sedang spot yang berwarna coklat kemungkinan terbentuk dari kotoran yang berasal dari tanah atau kompos. Pada sampel hari ke-14 (3) terdapat spot berwarna kuning keemasan dan orange dengan Rf 0.67 dan 0.8 ini diduga adalah merupakan senyawa turunan
hasil degradasi diazinon oleh SMC namun senyawa ini belum dapat