DAFTAR LAMPIRAN
LAMELLA TENGAH DINDING SEL
chitinase glucanase mRNA ER phytoalexins exo- endo- CENDAWAN pectinase cellulase CENDAWAN GOLGI KALI
genetik pertama menggunakan 6 karakter morfologi (disebut faktor) pada lalat buah (Drosophila melanogaster) pada tahun 1913 (Sturtevant 1913). Selanjutnya Kalr Sax menemukan bukti pertautan genetik antara lokus kualitatif dan lokus kuantitatif (QTL) pada kacang buncis (Phaseolus vulgaris) (Sax 1923). Sejak saat itu marka genetik telah berkembang dari marka morfologi kemudian marka isozyme (biokimia) dan marka DNA. Saat ini marka genetika telah digunakan baik untuk penelitian dasar maupun untuk pemuliaan tanaman.
Marka Morfologi
Marka berdasarkan karakter morfologi mudah diamati tetapi sangat mudah dipengaruhi oleh lingkungan, polimorfisme dan heritabilitas rendah, dan beberapa di antaranya mempunyai perkembangan yang terlambat seperti perkembangan bunga, yang bisa membuat pengamatan skor menjadi terlambat juga (Smith & Smith 1992). Selain itu adanya fenomena satu marka morfologi juga dapat mempengaruhi marka morfologi lainnya atau disebut “Pleiotropy” (Stearns 2010). Yang terpenting, kelemahan dari marka morfologi adalah jumlahnya yang terbatas, sehingga tidak bisa dilakukan analisis seperti QTL. Hal yang sama juga tidak bisa dilakukan oleh marka isozyme (Liersch et al. 2013). Dengan adanya marka DNA atau disebut marka molekuler, keterbatasan yang ada pada marka morfologi dan isozyme dapat diatasi.
Beberapa metode telah digunakan untuk mengkaji variabilitas yang ada pada plasma nutfah Musa. Karakter morfo-taksonomi pertama kali dikembangkan dan dioptimalisasi pada tanaman pisang dan diperoleh 119 diskriptor untuk mengkarakterisasi plasma nutfah pisang (Horry & Arnaud 1997). Diskriptor tersebut didasarkan pada karakter dasar yang dimiliki oleh Musa acuminata (mewakili genom ‘A’) dan Musa balbisiana (mewakili genom ‘B’). Namun demikian besarnya pengaruh lingkungan, tahapan pertumbuhan dan perkembangan tanaman dan besarnya keragaman Musa bisa merupakan faktor pembatas untuk penggunaan karakter morfologis di bidang taksonomi. Selain itu karakter morfologi dikendalikan oleh sejumlah kecil gen yang tidak mewakili keragaman genetik dari keseluruhan genom Musa (Saraswati et al. 2011).
Marka Isozyme
Sebagian besar studi pada Musa menggunakan marka isozyme adalah untuk analisis keragaman genetik (Bath et al. 1992a) dalam genus, mengidentifikasi variasi somaklonal dan mengidentifikasi tanaman hasil fusi protoplas (Bath et al. 1992b). Rivera (1983) menggunakan peroxidase dan polyphenoloxidase untuk membedakan subgroup Saba (ABB) dengan Bluggoe (ABB). Jarret & Litz (1986a,b) menguji efisiensi dan aplikasi beberapa isozyme seperti shikimate dehydrogenase (SKDH), malate dehydrogenase (MDH), peroxidase (PRX), phosphoglucomutase (PGM) dan glutamate oxaloacetate transminase (GOT). Beberapa di antaranya dapat digunakan untuk membedakan klon pada beberapa subgroup Musa. Espino & Pimentel (1990) menggunakan MDH untuk membedakan genom AAB dan ABB dengan genom BB, sedangkan Liyanage et al. (1998) menggunakan alloenzyme dari esterase untuk membedakan kultivar yang mengandung genom”A” dan “B”. Sementara itu Megia et al. (2001) menggunakan isozyme MDH, PRX dan GOT untuk menganalisa keragaman 100 kultivar Musa asal Indonesia yang bergenom AA, AAA, AAB, ABB dan BB, diketahui bahwa polimorfisme yang tinggi ada pada MDH dan PRX. GOT mempunyai polimorfisme terendah. Dhanya et al. (2006) menggunakan PRX untuk
mengidentifikasi kultivar yang tahan terhadap banana bract mozaic virus (BBrMv). Marka Molekuler
Marka molekuler didefinisikan sebagai segmen DNA tertentu yang mewakili perbedaan pada tingkat genom. Marka molekuler bisa mewakili ekspresi fenotipik suatu karakter ataupun tidak. Marka molekuler menawarkan sejumlah manfaat dibanding marka morfologis antara lain sifatnya stabil dan bisa dideteksi pada semua jaringan tanaman, semua tahap pertumbuhan dan perkembangan tanpa dipengaruhi oleh lingkungan, pleitropic dan epistasi, serta perbedaan genetik dapat diketahui sejak awal pertumbuhan (Agrawal et al. 2008).
Marka molekuler secara luas telah digunakan pada tanaman pisang dan kerabatnya (Musaceae) terutama untuk identifikasi variasi dan kekerabatan genetik plasma nutfah pisang, identifikasi duplikasi aksesi pisang di koleksi lapang dan kultur jaringan, monitoring stabilitas genetik materi kultur jaringan, analisis genotipe pisang hasil radiasi dan identifikasi marka suatu karakter dalam program pemuliaan (Pillay et al. 2012). Berdasarkan pola ekspresi polimorfisme, marka DNA dibagi menjadi 2 kategori, yaitu polimorfisme berbasis hibridisasi, dan berbasis polymerase chain reaction (PCR). Marka DNA berbasis hibridisasi yang digunakan adalah restriction fragment length polymorphism (RFLP) (Sanbrook et al. 1989) dan variable number tandem repeats (VNTR) loci (Rogstad 1993; Crouch et al. 1999).
Restriction fragment length polymorphism (RFLP) adalah keragaman panjang fragmen DNA karena adanya enzim restriksi yang memotong DNA pada situs yang sesuai dengan situs pemotongan dari enzim restriksi tersebut. RFLP adalah marka ko- dominan yang dapat membedakan homozigot dan heterozigot. RFLP telah digunakan dalam studi taksonomi, kekerabatan plasma nutfah spesies Musa dan studi keragaman dari genom kloroplas (Gawel & Jarret 1991; Gawel et al. 1992; Nwakanma et al. 2003). Bath et al. (1994) memanfaatkan teknik RFLP untuk membedakan kultivar pisang. Namun demikian RFLP kurang digunakan dalam kegiatan pemuliaan tanaman karena tingginya biaya operasional.
Variable number tandem repeats (VTNR) adalah sekuen DNA pendek yang berulang yang ada pada DNA genom. VTNR atau repetitive DNA sequence jumlahnya sangat banyak dan tersebar dalam genom eukariot (Frediani et al. 2004). VTNR bisa berupa minisatelit (10-45 bp) ataupun mikrosatelit (2-6 bp). Identifikasi VTNR pada awalnya menggunakan probe radioaktif, namun demikian sekarang telah banyak menggunakan teknik berbasis PCR. Crouch et al. (1999a) menggunakan analisis VTNR untuk membandingkan kesamaan genetik hibrida full-sib 2x dan 4x plantain dengan genotipe tetuanya.
Setelah dipublikasikannya penemuan teknologi PCR oleh Mullis & Faloona (1987), marka molekular berbasis PCR makin berkembang karena kemudahan dan peluang keberhasilannya yang tinggi. Beragam teknik berbasis PCR telah digunakan untuk menganalisis keragaman genetik, hubungan kekerabatan antara spesies liar dengan kultivar Musa, antara lain random amplified polymorphic DNAs (RAPD), microsatellite atau simple sequence repeat (SSR), amplified fragment length polymorphism (AFLP), inter-retrotransposon amplified polymorphism (IRAP), diversity arrays technology (DArT) dan single nucleotide polymorphisms (SNP) .
Kelebihan dari RAPD adalah mudah dalam penanganan dan biaya operasional yang relatif murah, dibutuhkan jumlah DNA sedikit dan tidak diperlukan informasi genom dari organisme yang dianalisis. Namun demikian, RAPD mempunyai
kelemahan, yaitu reproduktifitas yang terbatas, bersifat marka dominan dan reliabilitas yang tergantung pada keterampilan dari operator. RAPD telah berhasil digunakan untuk menganalisis keragaman plasma nutfah Musa (Howell et al. 1994; Bhat & Jarret 1995; Pillay et al. 2001; Uma et al. 2006; Nsabimana & Staden 2007), membedakan klasifikasi group dari Musa dan kerabatnya (Pillay et al. 2000; Bhat & Jarret 1995), hibrida full-sib populasi pemuliaan plantain (Crouch et al. 2000), menguji keseragaman tanaman hasil perbanyakan embriogenesis somatik (Meenakshi et al. 2011), dan untuk mendeteksi komposisi genom A atau genom B pada plasma nutfah dan hibrida Musa (Oselebe et al. 2006; Pillay et al. 2006). Selain itu peta tautan genetik berhasil dibuat dengan berbagai marka termasuk di antaranya RAPD (Faure et al. 1993). Marka RAPD yang dikonversi menjadi sequence-characterized amplified region (SCAR) digunakan sebagai alat untuk melakukan seleksi tidak langsung ketahanan tanaman pisang terhadap penyakit bercak daun sigatoka (Nwauzoma et al. 2011) dan layu fusarium (Wang et al. 2012).
Mikrosatelit atau simple sequence repeats (SSR) dikembangkan untuk menutupi kekurangan yang terdapat pada RAPD (Jarret et al. 1994; Mattos et al. 2010). Lokus SSR jumlahnya berlimpah dan tersebar secara acak, merupakan lokus spesifik, kodominan dan marka multi-allelic. Keuntungan marka SSR adalah marka yang bisa direproduksi karena jumlahnya yang melimpah, polimorfik dan reliabilitas (Kashi et al. 1997; Li et al. 2004). Marka SSR telah banyak digunakan untuk mengidentifikasi keragaman genetik spesies tanaman, analisis sidik jari, pemetaan genetik. Analisis simple sequence repeat length polymorphism (SSRLP) telah dapat mendeteksi tingkat polimorfisme yang tinggi antar individu populasi pemuliaan Musa (Crouch et al. 2000). Saat ini telah diidentifikasi ratusan marka SSR baik yang berasal dari M. acuminata maupun M. balbisiana (Wang et al. 2010; Amorim et al. 2012).
Salah satu marka yang bernama Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism (IRAP) adalah merupakan komplementer marka dominan yang digunakan untuk mendeteksi polimorfisme dalam insersi retrotransposon. Retrotransposon bertindak sebagai agen mutagenik yang memberikan sumber keragaman pada tanaman termasuk Musa (Heslop-Harrison 2000). Kelas utama dari retroelement termasuk di dalamnya terbagi dalam beberapa kelas terutama long interspersed elements (LINES), short interspersed elements (SINES), copia dan gypsy- like elements, dan retroviruses. Tao et al. (2005) menggunakan marka IRAP untuk mengidentifikasi dan mengkarakterisasi kultivar pisang dan klasifikasi genom Musa. Beberapa penelitian mengenai marka IRAP, menunjukkan bahwa marka IRAP dapat digunakan untuk mengidentifikasi komposisi genom (A atau B) pada pisang-pisang komersial, sehingga akan membantu dalam pengelompokan berdasarkan genomnya (Balint-Kurti et al. 2000; Aert et al. 2004; Nair et al. 2005).
Amplified Fragment Length Polymorphisms (AFLP) adalah teknik sidik jari berdasarkan amplifikasi PCR fragmen yang telah dipotong mengunakan enzim restriksi (Vos et al. 1995). Marka AFLP telah banyak digunakan pada berbagai tanaman karena kemampuannya untuk menghasilkan polimorfisme yang tinggi dengan sekali analisis. Marka AFLP telah digunakan untuk mendeteksi keragaman kultivar dan progenitor liar Musa (Ude et al. 2002a,b: Opara et al. 2010). Kelemahan dari AFLP adalah memerlukan manipulasi DNA (ligasi) dan teknik visualisasi yang cukup komplek, serta membutuhkan biaya yang relatif besar. Selain itu analisis AFLP memerlukan kualitas dan kuantitas DNA cukup tinggi. Lheureux et al. (2003) menemukan bahwa 10 marka AFLP bersegregasi dengan ada atau tidak adanya infeksi banana streak badnavirus
pada hibrida Musa. Marka AFLP dikombinasi dengan SSR telah digunakan untuk mengidentifikasi sifat partenokarpi, cebol, dan dominasi apikal pada tanaman pisang (Crouch et al. 1999b; Hautea et al. 2004)
Diversity Arrays Technology (DArT) teknologi genotyping berbasis hibridisasi DNA tanpa memerlukan informasi sekuen DNA genom. DArT awalnya digunakan pada tanaman padi (Jaccoud et al. 2001) tetapi sekarang sudah digunakan pada tanaman ketela pohon, gandum, Arabidopsis, pisang (Wittenberg et al. 2005; Xia et al. 2005; Zhang et al. 2011; White et al. 2008;Hippolyte et al. 2010). Marka DArT adalah teknologi yang relatif murah yang membutuhkan sedikit DNA, tetapi memberikan hasil yang dapat mencakup informasi genom secara luas (Stodart et al. 2007). Sebanyak 1500 marka DArT telah dihasilkan pada aksesi Musa dan 380 marka di antaranya telah digunakan dalam pembuatan peta genetik BORLI di CIRAD (Hippolyte et al. 2010). Amorim et al. (2009) menggunakan 653 marka DArT untuk mengevaluasi keragaman pisang dengan kandungan karotin tinggi. Kelemahan dari teknologi DarT adalah tergantung pada ketersediaan printer dan scanner microarray, komputer untuk menganalisis, menyimpan dan mengelola data. Namun demikian apabila marka telah disekuen dapat digunakan untuk analisis berbasis PCR dan peralatan elektroforesis standar (Pillay et al. 2012).
Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) adalah polimorfisme yang disebabkan oleh perbedaan satu situs nukleotida tertentu dalam genom organisme. Keberadaan SNP melimpah dan tersebar pada genom organisme, walaupun kejadian dan distribusinya berbeda tiap organisme, seperti pada jagung terjadi 1 SNP per 60-120 pb (Ching et al. 2002), pada manusia diperkirakan terjadi 1 SNP per 1000 pb (Sachidanandam et al. 2001). Kebanyakan SNP ditemukan di luar dari gen fungsional (non-coding region) (Sherry et al. 2001). SNP yang terdapat pada gen fungsional (coding region) mendapat perhatian khusus karena secara langsung berhubungan dengan sifat yang diekspresikan oleh gen yang bersangkutan, oleh karena itu marka SNP dibuat berdasarkan sekuen dari expresses sequence tags (ESTs) (Shu et al. 2010). SNP yang ditemukan di coding region dibagi menjadi 2, yaitu yang bersifat non- synonymous yang bisa merubah asam amino, dan yang synonymous yang tidak merubah asam amino (Sunyaev et al. 2001).
Makin berkembangnya teknologi sequencing ditandai dengan munculnya high throughput sequencing platform, antara lain Roche/454 FLX (Margulies et al. 2005), Illumina/Solexa Genome Analyzer (Bentley 2006), Applied Biosystems SOLiDTM System, membuat proses sequencing menjadi lebih efisien dan biaya sequencing secara signifikan dapat dikurangi. Sejumlah besar genom dan transkriptom yang berasal dari tanaman jagung (Barbazuk et al. 2007), rapa (Trick et al. 2009) dan manusia (Li et al. 2009) telah di-sequencing untuk mengidentifikasi SNP. Teknik untuk genotyping SNP juga telah berkembang menggunakan Taqman (Shen et al. 2009), Amplifluor (Myakishev et al. 2001), Multiplexed Anchored Runoff Amplification (MARA) (Shapero et al. 2004) dan SNP array (Shen et al. 2005). Namun demikian teknik tersebut memerlukan biaya yang cukup tinggi dan peralatan khusus, sehingga tidak sesuai untuk genotyping SNP berskala kecil. Oleh karena itu sejumlah laboratorium masih melakulan validasi SNP menggunakan teknik berbasis enzim restriksi dan PCR, seperti Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS), derived CAPS (dCAPS) (Thiel et al. 2004; Nasu et al. 2002) dan Allel Specific-PCR (AS-PCR) atau Single Nucleotide Amplified Polymorphism (SNAP) (Drenkard et al. 2000).
antara lain untuk membedakan spesies pada aksesi jeruk (Jiang et al. 2010), membuat peta tautan beresolusi tinggi pada ketela pohon dan kacang tunggak (Rabbi et al. 2012; Mucheroa et al. 2009), mengidentifikasi varietas ginseng (Sun et al. 2011) dan mengidentifikasi Cannabis yang bersifat narkotika atau tidak (Rotherham & Harbison 2011). Sementara itu Varshney et al. (2007) membandingkan marka berbasis SNP, SSR dan AFLP asal barley dan diperoleh bahwa marka berbasis SNP sesuai untuk karakterisasi dan konservasi, sedangkan SSR dan AFLP sesuai untuk analisis keragaman dan sidik jari. Yang et al. (2004) mengidentifikas 2 SNP yang bertautan dengan QTL yang berhubungan dengan warna buah pada tanaman tomat. Namun demikian informasi pemanfaatan marka berbasis SNP pada tanaman pisang masih terbatas pada studi genetik tanaman. Umali & Nakamura (2003) menggunakan marka dCAPS untuk membedakan sitoplasma pisang yang bergenom “A” dan B”. Adesoye et al. (2012) mengidentifikasi SNP yang dapat digunakan untuk pemetaan QTL yang berhubungan dengan kandungan gibberelin dan sifat partenokarpi.
Perumusan Masalah
Salah satu kendala dalam budidaya tanaman pisang adalah serangan penyakit. Salah satu penyakit utama yang sulit dikendalikan baik secara kimia, kultur praktis maupun biologis adalah layu yang disebabkan cendawan Fusarium oxysporum f.sp. cubense (FOC). Sampai dengan saat ini telah diidentifikasi bahwa cendawan FOC yang menyerang pertanaman pisang di Indonesia adalah FOC ras 1, 2, 4 dan ras 4 tropika (TR-4). Berdasarkan hasil survey yang dilakukan oleh Balai Penelitian Tanaman Buah Tropika pada tahun 2007, diperoleh data bahwa di hampir semua daerah sentra produksi pisang telah ditemukan penyakit layu FOC ras 4 tropika dengan intensitas serangan yang beragam. Hal ini sangat mengancam keberadaan pertanaman pisang komersial, karena beberapa kultivar yang tahan terhadap FOC ras 1, 2 dan 4, ternyata tidak tahan terhadap FOC ras 4 tropika.
Di lain pihak sumber daya genetik pisang di Indonesia sangat melimpah dengan ditemukannya beragam kultivar komersial dan non-komersial maupun spesies liar. Berdasarkan hasil pengamatan di lapangan juga ditemukan tidak semua kultivar terinfeksi FOC TR-4 walaupun tumbuh di daerah endemik penyakit tersebut. Hal ini menunjukkan adanya mekanisme ketahanan dan pertahanan terhadap penyakit di dalam tanaman tersebut.
Dengan telah diidentifikasinya sejumlah gen ketahanan (R gene) dan resistance gene analogue (RGA) pada berbagai tanaman, studi isolasi dan karakterisasi RGA pada tanaman pisang dapat dilakukan berdasarkan motif terkonservasi pada gen ketahanan yang tanaman lain. Isolasi dan karakterisasi RGA pada tanaman pisang yang tahan terhadap penyakit layu FOC diharapkan akan diperoleh kandidat gen ketahanan yang nantinya bisa ditransfer ke kultivar komersial lainnya melalui program pemuliaan tanaman.
Selain gen ketahanan, perlu dikarakterisasi juga gen-gen yang berperan dalam mekanisme pertahanan tanaman, 2 di antaranya yang menyandi protein chitinase dan β-
1,3-glucanase. Kedua kelompok gen baik gen ketahanan maupun gen pertahanan, dapat diidentifikasi adanya SNP yang dapat dikembangkan menjadi marka SNAP, yang bisa diimplementasikan sebagai instrumen seleksi dalam program pemuliaan tanaman.
Tujuan Penelitian
1. Menguji secara dini ketahanan beberapa kultivar pisang terhadap penyakit layu Fusarium VCG 01213/16 (TR4).
2. Mengisolasi dan mengkarakterisasi resistance gene analogue (RGA) pada 3 kultivar pisang tahan terhadap penyakit layu FOC.
3. Mengisolasi dan mengkarakterisasi gen chitinase dan β-1,3-glucanase pada
beberapa kultivar pisang.
4. Mengidentifikasi dan menganalisis putatif SNP pada sekuen RGA dan DGA (gen chitinase dan β-1,3-glucanase) asal tanaman pisang.
5. Mengembangkan marka SNAP berbasis RGA dan DGA (gen chitinase dan β-1,3-
glucanase) untuk marka seleksi ketahanan terhadap penyakit layu FOC.
Manfaat Penelitian
Dengan diperolehnya teknik pegujian secara dini, proses seleksi ketahanan tanaman pisang terhadap penyakit layu Fusarium bisa dilakukan lebih awal, membutuhkan waktu yang lebih singkat, biaya yang relatif rendah serta tidak membutuhkan tempat atau ruang yang luas.
Adanya informasi karakter RGA dan DGA (chitinase dan β-1,3-glucanase)
yang berasal dari tanaman pisang, akan dapat dilakukan pengujian ekspresi untuk menentukan gen-gen yang bertanggung jawab terhadap ketahanan dan pertahanan tanaman terhadap penyakit pisang khususnya layu FOC. Selain itu di dalam sekuen RGA dan DGA, akan dapat diidentifikasi keberadaan SNP yang bisa dibuat marka SNAP untuk ketahanan terhadap penyakit. Marka yang dihasilkan dapat digunakan untuk mendukung pengembangan marker assisted selection (MAS) yang akan membantu percepatan dan peningkatan akurasi proses seleksi dalam program pemuliaan tanaman pisang.
Ruang Lingkup Penelitian
Kegiatan penelitian ini mempunyai ruang lingkup yang berbeda, tetapi saling berkaitan untuk mencapai tujuan yang telah ditetapkan. Adapun tahapan-tahapan percobaan yang dilakukan adalah sebagai berikut: Percobaan 1: Menguji dini ketahanan beberapa kultivar pisang terhadap penyakit layu FOC VCG 01213/16 (TR4), untuk menentukan kultivar yang tahan layu FOC yang akan digunakan untuk percobaan 2. Percobaan 2: Mengisolasi dan mengkarakterisasi resistance gene analogue (RGA) asal 3 kultivar pisang yang tahan penyakit layu fusarium, menggunakan degenerate primers. Percobaan 3: mengisolasi dan mengkarakterisasi gen chitinase asal 5 kultivar pisang Percobaan 4: mengisolasi dan mengkarakterisasi gen β-1,3-glucanase asal 4 kultivar pisang. Percobaan 5: mengidentifikasi dan
menganalisis keragaman substitusi satu basa nukleotida (SNP) pada sekuen RGA dan DGA berdasarkan hasil proses perunutan (sequensing) DNA genom asal beberapa kultivar pisang. Percobaan 6: Mengembangkan marka SNAP berbasis RGA dan DGA (gen chitinase dan β-1,3-glucanase) asal tanaman pisang untuk marka ketahanan
Gambar 5 Diagram a Beberapa Panama (F .
alur kegiatan penelitian ‘Karakterisasi Molekul a Kultivar Pisang (Musa spp.) Terhadap
Fusarium oxysporum f.sp. cubense)’
olekuler Ketahanan p Penyakit Layu