TINJAUAN PUSTAKA
2.3 ENZIM LIPASE
Lipase adalah enzim-enzim yang mengkatalisis hidrolisis ester karboksilat dalam molekul triasilgliserol untuk membentuk asam lemak bebas, di- dan monogliserida dan gliserol. Meskipun fungsi alami mereka adalah untuk mengkatalisis hidrolisis ester, mereka juga dapat mengkatalisis esterifikasi. Karena mereka dapat mengkatalisis hidrolisis, alkoholisis, esterifikasi dan transesterifikasi mereka memiliki spektrum yang luas dari aplikasi bioteknologi [10]. Ada dua kategori utama enzim sebagai biokatalis : (1) lipase ekstraseluler (yaitu enzim yang sebelumnya telah dipulihkan dan dimurnikan dari kaldu yang dihasilkan oleh mikroorganisme hidup). Produsen utama yaitu mikroorganisme Mucor miehei, Rhizopus oryzae, Candida antarctica dan Pseudomonas cepacia; (2) lipase intraseluler yang masih tersisa baik di dalam sel ataupun di dinding sel yang memproduksinya; dimana dua kategori enzim tersebut merupakan enzim terimobilisasi [24].
Enzim, termasuk lipase, memiliki struktur tiga dimensi aktif tertentu dalam media encer dengan gugus polar terbuka dan gugus nonpolar tersembunyi. Tidak seperti enzim lainnya, sifat dasar reaksi lipolitik yang dikatalisis oleh lipase sangat kompleks, di mana substrat lipid tidak larut dalam air. Air diperlukan untuk mempertahankan dan mengaktifkan lipase dan lipid yang tidak larut dalam air membuat media reaksi heterogen dengan membentuk antarmuka cair-cair. Antarmuka adalah titik dimana lipase dapat mengakses substrat dan mengkatalis reaksi. Aktivitas lipase mudah dipengaruhi oleh sifat dasar antarmuka, sifat antarmuka, dan luas antarmuka. Antarmuka mengaktifkan enzim melalui adsorpsi, yang membantu terbukanya tutup pada sisi katalitik. Semua jenis antarmuka, seperti padat-cair, cair-cair, atau gas-cair, dapat mempengaruhi aktivitas akibat
10
adanya hidrofobisitas antarmuka. Peningkatan luas antarmuka akan meningkatkan jumlah enzim yang teradsorbsi, sehingga dapat meningkatkan aktivitas enzim dalam lipid atau sistem air heterogen. Adsorpsi enzim ke antarmuka mengawali serangkaian proses sebelum katalisis lengkap tercapai dan mengarah ke aktivasi dan pengikatan substrat yang diikuti oleh katalisis. Penumpukan produk reaksi pada antarmuka akan mengurangi tegangan permukaan, yang berkaitan dengan energi permukaan yang tinggi. Hal ini tidak dikehendaki karena menyebabkan terjadinya dampak denaturasi pada molekul enzim [29].
Secara sederhana, mekanisme kerja enzim dapat dilihat pada gambar di bawah ini [30].
Gambar 2.2 Mekanisme Kerja Enzim
Dari gambar di atas dapat dilihat bahwa mekanisme kerja enzim diawali dengan pengontakkan antara substrat dengan sisi aktif enzim yang kemudian akan membentuk sebuah kompleks enzim-substrat dimana substrat akan diubah menjadi produk yang kemudian akan dilepaskan dan enzim diperoleh kembali seperti semula untuk selanjutnya bereaksi kembali dengan substrat [30].
2.4NOVOZYM® 435
Salah satu jenis enzim lipase terimmobilisasi yang telah banyak digunakan dalam produksi biodiesel yaitu Novozym® 435. Novozym® 435 dapat digunakan untuk mengkatalisasi transesterifikasi dan reaksi hidrolisis untuk produksi biodiesel. Novozym® 435 memiliki struktur berpori dan lebih sensitif terhadap perubahan rasio mol serta dapat mencapai konversi yang tinggi dengan rasio mol, temperatur dan jumlah katalis yang lebih rendah [31].
11
Sifat-sifat dari Novozym® 435 dapat dilihat pada tabel 2.3 berikut. Tabel 2.3 Sifat Biokatalis Novozym® 435 [31]
Sifat katalis Candida antartica lipase B (CALB) bergerak di resin akrilik
Sifat fisik Berbentuk manik-manik bulat berwarna putih
Distribusi ukuran partikel :
d10 (µm) 252
d50 (µm) 472
d90 (µm) 687
Luas permukaan BET (m2/g) 81,6 Volume pori total (cm3/g) 0,45 Diameter pori rata-rata (nm) 17,7
Densitas (g/cm3) 1,19
Porositas 0,349
Kapasitas asam (mmol/g) 0,436
2.5SOLVENT
Transesterifikasi dapat dilakukan baik menggunakan pelarut organik atau dalam media bebas pelarut. Contoh pelarut organik non-polar yang sangat baik untuk minyak yaitu heksana [24]. Tujuan penggunaan pelarut organik untuk transesterifikasi yaitu untuk memastikan campuran reaksi bersifat homogen, mengurangi viskositas campuran reaksi sehingga meningkatkan laju difusi dan dapat mengurangi masalah perpindahan massa di sekitar enzim [12], untuk meningkatkan stabilisasi enzim sehingga memungkinkan untuk digunakan berulang kali [32], dan juga meningkatkan kelarutan alkohol dan sehingga dapat mengurangi efek inaktivasi alkohol dan gliserol pada aktivitas lipase [33]. Namun, pelarut organik bersifat volatil dan menghasilkan limbah beracun sehingga berbahaya bagi kesehatan manusia dan lingkungan [34].
Room temperature ionic liquids (RILs) dianggap sebagai alternatif yang ramah lingkungan pengganti pelarut organik yang dianggap berbahaya. ILs merupakan garam yang tidak mudah menguap, tekanan uapnya dapat diabaikan dimana tekanan uapnya bisa sangat kecil (<1 Pa) bahkan pada suhu yang relatif tinggi (200 sampai 300 ºC), mempunyai polaritas tinggi, dapat menghantarkan listrik karena terdiri dari anion dan kation, tidak mudah terbakar serta stabil secara termal dan kimia [35–36]. ILs memiliki sifat hidrofobik, terdiri dari anion kosmotropik dan kation kaotropik yang biasanya dapat meningkatkan aktivitas
12
dan stabilitas enzim [37]. Selain itu, ILs memiliki potensi untuk didaur ulang dan digunakan kembali serta mampu menyediakan media reaksi yang bersih dengan limbah yang minimum [38].
Secara keseluruhan, metode untuk menstabilkan dan mengaktifkan enzim dalam ILs dibagi menjadi dua kategori umum, yaitu modifikasi enzim, dan modifikasi lingkungan pelarut. Kategori pertama termasuk imobilisasi enzim dan sebagainya dimana bertujuan agar enzim lebih toleran terhadap faktor penyebab denaturasi ILs. Kategori kedua meliputi penggunaan aditif di ILs dan sebagainya dimana bertujuan untuk meminimalkan sifat denaturasi dari beberapa ILs [39].
Pelarut eutektik berbasis kolin dapat digunakan sebagai media persiapan enzimatik biodiesel [8]. Pelarut eutektik berbasis kolin termasuk dalam deep eutectic solvents (DES) yang merupakan ionic liquid tingkat lanjut. DES adalah campuran garam seperti ChCl dan pemberi ikatan hidrogen bermuatan seperti urea, asam oksalat, atau gliserol. Misalnya, campuran ChCl dan urea dalam rasio molar 1 : 2 yang diencerkan untuk membentuk DES. Ionic liquid berbasis ChCl digunakan sebagai pelarut dalam reaksi transesterifikasi enzimatik karena memiliki keunggulan dibandingkan dengan pelarut organik biasa yang larut dalam air dan pelarut polar organik, yaitu tidak menonaktifkan enzim, lebih ramah lingkungan dari pelarut organik karena merupakan senyawa nonvolatil, dan dapat dibuat dari komponen tidak beracun, harganya lebih murah dan biayanya sama dengan pelarut organik karena tidak memerlukan pemurnian [11].
Stabilisasi enzim di dalam ionic liquids solvent (ILs) adalah salah satu kunci untuk pengembangan proses biokatalitik, aplikasi lingkungan, atau biomedis untuk industri yang lebih efisien. Penggunaan enzim dalam ILs menyajikan keuntungan yang berbeda ketika dibandingkan dengan pelarut organik konvensional . Di sisi lain, dalam beberapa kasus aplikasi enzim dapat dibatasi oleh kelarutan yang rendah, kegiatan atau stabilitas di ILs. Peningkatan fungsi enzim sangat penting untuk aplikasi skala besar untuk menguntungkan secara ekonomis. Metode untuk menstabilkan dan mengaktifkan enzim dalam ILs dapat dibagi menjadi dua strategi yang berbeda yaitu dengan cara modifikasi enzim dan modifikasi pelarut. Modifikasi enzim termasuk liofilisasi (untuk mengubah
13
morfologi enzim padat), modifikasi kimia (untuk penambahan fungsi kimia ke dalam biomolekul enzim) dan immobilisasi dalam media yang cocok. Selain itu, memahami faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim dan stabilitas di media ILs juga sangat penting. Telah dilaporkan bahwa reaksi enzim dalam ILs dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti aktivitas air, pH, bahan pembantu dan kotoran. Beberapa karakteristik ILs juga berkaitan dengan aktivitas dan stabilitas enzim. Yang paling penting yaitu polaritas, kapasitas ikatan hidrogen, viskositas dan hidrofobik dimana jenis dan kekuatan interaksi ILs dengan molekul enzim pasti akan mempengaruhi struktur 3D mereka. Pengaruh tersebut dapat mengakibatkan atau tidak perubahan aktivitas enzim [40].
Gambar 2.3 Stabilitas Enzim dalam Cairan Ionik [41]