Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret 2005 sampai dengan bulan April 2006. Penelitian dilaksanakan dalam tiga tahap yang meliputi :
1. Penelitian dilapangan yaitu pengambilan data ukuran tubuh kuda yang dilaksanakan di arena pacuan Kuda Pulomas Jakarta dan pengambilan sampel darah kuda lokal yang dilaksanakan di Jakarta Selatan, Sumatra Barat, Jawa Barat dan Yogyakarta.
2. Penelitian Laboratorium, dilaksanakan dari bulan Juni 2005 sampai dengan bulan April 2006 di Laboratorium Genetika Bidang Zoologi-Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia Cibinong, Bogor
3. Analisis Sekuensing, dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi di kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang.
Materi Penelitian Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ukuran tubuh Kuda Pacu Indonesia, yang diperoleh dari Pacuan Kuda Pulomas, Jakarta. Sampel DNA genom kuda yang diperoleh dari sampel darah 36 ekor kuda lokal yang berada di Jakarta Selatan, Sumatera Barat, Jawa Barat dan Jawa Tengah.
Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah larutan penyangga pelisis A (lysis buffer), larutan penyangga pencuci B (rinse buffer), larutan penyangga digesti C (digestion buffer), proteinase-K (10 mg/ml), RNAse (10 mg/ml), phenol, phenol chloroform, ethanol 100%, ethanol 70%, buffer TE, 1xbuffer TAE, ethidium bromide (10 mg/ml), agarose 2%, loading dye, marker 100 pb ladder, taq polymerase, H2O, PCR buffer+MgCl2, purified BSA 100x, dNTP 2.5 mM, primer 12SrRNA, air milliQ.
Peralatan yang digunakan untuk mengukur ukuran tubuh kuda adalah kaliper, pita ukur dan tongkat ukur dengan satuan cm. Peralatan yang digunakan untuk analisis DNA genom kuda adalah tabung ependorf dengan ukuran 0.2-1.5 ml, refrigerated microcentrifuge (high speed), general centrifuge, kotak penyimpanan sampel, rak tabung ependorf, vortex mixer, pipetor atau pipetman dengan ukuran 2-1000 ml, tip pipet (warna biru, putih dan kuning), sarung tangan
(hand glove), shaking water bath, autoclave, rotary mixer, aspirator, gunting, mesin thermo cycler, horizontal agarose gel electrophoresis apparatus (MUPID), well forming combs, power supply, microwave, camera polaroid, alat timbang (balance), plastic cling wrap dan UV transilluminator.
Metode Penelitian
Pengambilan Sampel Darah
Darah kuda diambil melalui vena jugularis pada bagian leher yang telah diolesi alkohol 70% menggunakan suntikan dengan ukuran 5 ml. Setiap sampel darah yang telah diambil ditempatkan pada tabung yang telah diberi larutan EDTA sebanyak 1 ml kemudian digoyang secara perlahan hingga larutan homogen. Setiap tabung diberi label identifikasi (berisi nomor sampel dan lokasi pengambilan) dan selanjutnya disimpan di dalam lemari es (freezer) dalam keadaan beku sampai proses ekstraksi DNA dilakukan.
Ekstraksi dan Purifikasi DNA
Ekstraksi dan purifikasi DNA dilakukan dengan cara sampel darah ditempatkan pada 1.5 ml tabung ependorf. Apabila sampel darah yang digunakan menggumpal maka sampel tersebut harus dihaluskan terlebih dahulu dengan mortar kemudian diuapkan atau hilangkan sisa-sisa ethanolnya. Selanjutnya tambahkan larutan penyangga pelisis A (lysis buffer) dengan volume yang sama dan kocok secara manual sampai larut. Sentrifugasi dengan kecepatan 6500 rpm selama 1 menit pada temperatur kamar. Supernatan dibuang sedangkan endapannya (erythrosit dan leukosit) ditambahkan larutan penyangga pencuci B (rinse buffer) dengan volume yang sama (200 μl), goyang-goyang dengan tangan dan divortex sampai endapan larut. Tambahkan larutan penyangga digesti C (digestion buffer) sebanyak 500 μl, 15 μl Proteinase K (10 mg/ml), dan 5 μl RNAase (10 mg/ml). Goyang dengan menggunakan tangan dan vortex sebentar. Inkubasikan dengan menggunakan shaking water bath pada temperatur 55OC selama kurag lebih 16 jam (over night).
Setelah sampel tercerna semua, ambil sampel dari inkubator dan ditambah phenol sebanyak 500 μl. Vortex atau menggunakan rotary mixer selama 30 menit sehingga larutan tercampur semua. Sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 2 menit, sehingga di dalam tabung ependorf terlihat larutan terpisah menjadi dua.
Ambil larutan bagian atas/supernatan (warna seperti putih telur) kemudian pindahkan ke tabung ependorf baru kemudian tambahkan phenol-chloroform (1:1) dengan volume yang sama, vortex atau menggunakan rotary mixer perlahan- lahan selama 30 menit. Sentrifugasi pada 13000 rpm selama 2 menit. Ambil bagian atas (supernatan berwarna putih) dan pindahkan ke tabung ependorf baru . Tambahkan ethanol 100 % sebanyak 2 kali volume sampel, digoyang dengan tangan selama 10 menit sehingga terbentuk material putih kemudian simpan di dalam freezer selama 5 menit dan sentrifugasi pada 13000 rpm selama 2 menit. Setelah disentrifugasi ethanol dibuang dan diganti dengan 70 % ethanol (600 μl) kemudian sentrifugasi pada 13000 rpm selama 2 menit. Ethanol 70 % dibuang secara hati-hati menggunakan pipetor agar pelet DNA tersebut tidak ikut terbuang bersama ethanol. Material/pelet dikeringkan dengan bantuan aspirator. Keluarkan larutan D dari tempat penyimpanannya (-20oC). Tambahkan larutan D sebanyak 100 μl. Sentrifugasi sebentar dan inkubasi dalam shaking water bath pada temperatur 37oC selama 15 menit. Simpan sampel DNA pada temperatur 4oC (Sulandari 2003).
Elektroforesis
Elektroforesis adalah proses migrasi dari fragmen DNA di dalam gel yang direndam dalam larutan penyangga dimana fragmen DNA yang mempunyai berat molekul lebih kecil akan berjalan lebih cepat daripada fragmen DNA yang mempuyai molekul lebih berat. Perjalanan molekul DNA di dalam gel mengikuti arus listrik dari kutub negatif ke kutub positif.
Proses elektroforesis menggunakan gel agarose dengan visualisasi menggunakan ethidium bromide dilakukan dengan cara meletakan gel agarose di dalam tank elektroforesis (MUPID) dan tuangkan larutan 1xbuffer TAE ke dalam tank tersebut hingga sekitar 1 mm di atas permukaan gel. Selanjutnya ambil sampel dengan menggunakan pipetor sebanyak 4 μl dan letakkan sampel diatas plastic cling wrap kemudian tambahkan loading dye sebanyak 1/10 volume sampel dan aduk hingga merata. Sampel yang telah tercampur dimasukkan ke dalam sumur (well) pada gel agarose kemudian tutup tank elektroforesis dan hubungkan dengan arus listrik selama 30 menit. Setelah proses elektroforesis selesai, matikan arus listrik dan ambil gel menggunakan sarung tangan. Letakan
gel pada UV transilluminator sehingga pita/band molekul DNA kelihatan terang dan dokumentasikan dengan menggunakan kamera polaroid (Sulandari 2003). Polymerase Chain Reaction
PCR dilakukan dengan cara menentukan jumlah sampel untuk analisis PCR. Menyiapkan tabung PCR 0.2 ml atau 0.5 ml yang telah disteril (tergantung jenis mesin Thermal cycler yang digunakan) dan jumlah tabung yang disiapkan sesuai dengan jumlah sampel kemudian memberi label/nama pada setiap tabung PCR setelah itu tambahkan sampel/template DNA ke dalam setiap tabung PCR.
Membuat coctail atau master mix yang mengandung buffer 1x, Taq polymerase 1.25 Unit/μl, dNTP 0.2 mM, air milliQ dan primer L1091 (5’-AAAAAGCTTCAAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3’) 12.5 pmol
dan H1478 (5’-TGACTGCAGAGGGTGACGGGGCGGTGTGT-3’) 12.5 pmol (Kocher et al. 1989) dengan menggunakan tabung ependorf 0.5 ml atau 1.5 ml (sesuai dengan volume coctail). Komponen PCR yang telah disebutkan diatas dicampur dengan konsentrasi tertentu. Bila jumlah sampel DNA yang dimasukkan adalah 3 μl, maka sebanyak 47 μl dari coctail dimasukkan ke masing-masing tabung yang telah berisi sampel DNA. Usahakan jangan sampai timbul gelembung udara. Kemudian masukkan tabung ke Thermal cycler machine dan jalankan mesin tersebut (tekan Start) sesuai program yang diinginkan (Sulandari 2003).
Sekuensing DNA
Sekuensing dilakukan melalui tahapan PCR yang dimulai dengan membuat campuran di dalam tabung PCR 0.2 ml dengan komposisi air steril 3 μl, primer 2
μl, bigdye V3.1 4 μl, dan template 1 μl setelah semua larutan tercampur kemudian disentrifugasi. Selanjutnya sampel dimasukan ke dalam mesin thermal cycler sebanyak 25 siklus dengan proses reaksi PCR sebagai berikut :
- Denaturasi : 96oC selama 2 menit
- Anneling : 96oC selama 10 detik
- Elongasi : 55oC selama 5 detik
- Post elongasi : 60oC selama 4 menit
Setelah proses PCR selesai sampel di purifikasi untuk melakukan proses sekuensing menggunakan mesin sekuensing ABI 3130 GENETIC ANALYZER
dengan cara menghidupkan mesin ABI 3130 (sampai lampu hijau menyala) kemudian klik run data collection (sampai semua kotak hijau), klik protocol manager {klik new, isi nama, type (reguler), run mode (Ultraseq 36_POP_1/Rapidseq 36_POP_1), dye set (Z-BigDye V3.1), klik OK}, klik plate manager (klik new, isi plate dialog, klik ok, isi plate record SEQ ANALYSIS PLATE EDITOR), klik run scheduler (klik FIND ALI, pilih plate nama dari daftar, klik posisi plate untuk link) selanjutnya pada start dialog box klik tanda panah warna hijau dan klik ok.
Pengukuran Ukuran Tubuh Kuda
Pengukuran ukuran tubuh dilakukan dengan cara mengukur bagian-bagian tubuh seperti tinggi badan, panjang badan, lebar dada dan tinggi punggung dengan menggunakan pita ukur, tongkat ukur dan kaliper. Pada saat melakukan pengukuran tubuh kuda, terlebih dahulu kuda ditempatkan di tempat yang datar dengan posisi kedua kaki depan tegak lurus seperti yang terlihat pada gambar 1 dibawah ini. Keterangan : A : Tinggi Badan B : Panjang Badan C : Lebar Dada
D : Tinggi Punggung E : Panjang Bahu
Tinggi badan diukur dari titik tertinggi processus spinalis dari vertebra thoracica tegak lurus ke lantai dengan menggunakan tongkat ukur. Panjang badan diukur mulai dari bagian point of shoulder sampai dengan point of buttock atau jarak dari titik cranial pada shoulder joint sampai titik caudal pada pin bone. Lebar dada diukur dengan menggunakan kaliper dari bagian dada (breast) sebelah
B A D
C
kiri dengan sebelah kanan atau jarak upper arm/pars cranialis pada tuberculum majus humeri sebelah kanan dan kiri. Tinggi punggung diukur dengan menggunakan tongkat ukur mulai dari bagian back /deepest point pada punggung tegak lurus sampai ke lantai. Panjang bahu diukur mulai dari bagian withers sampai shoulder joint (tuberculum majus humeri) dengan menggunakan kaliper (Zechner et al. 2001).
Analisis Data
Hasil sekuensing diolah dengan menggunakan program Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 3.1) untuk menganalisis pohon kekerabatan (phylogeny tree) dengan metode neighbor joining dengan nilai bootstrap sebesar 1000 untuk menentukan tingkat kepercayaan pada pohon kekerabatan tersebut (Nei dan Kumar 2000) dan untuk menganalisis jarak genetik (genetics distance) dengan persamaan sebagai berikut :
dAB = Σdij l (rs) dengan dij = -h ln (1-P/h-Q) – (1/2)(1-h) ln (1-2Q) dan h = 20(1-0)
(Nie dan Kumar 2000) Keterangan :
dAB : jarak antara cluster A dan B
dij : jarak antara taxa i dan j
r dan s: jumlah taxa di dalam cluster A dan B 0 : sin-1 persentase kandungan GC
P : frekuensi perubahan pasangan transisi pada gen A dan B Q : frekuensi perubahan pasangan transversi pada gen A dan B
Keragaman genetik diukur dengan nilai rataan heterozigositas pada semua lokus, baik lokus yang polimorfik atau monomorfik. Heterozigositas rata- rata/keragaman genetik (h). Dugaan unbiased dari h adalah :
ĥ = ) 1 2 ( ) 1 ( 2 2 − −
∑
n xi n (Nei 1987) Keterangan : n : jumlah sampelxi : frekuensi populasi dari alel ke i pada lokus tertentu
Ukuran tubuh kuda dianalisis dengan program SAS 6.12 dan Minitab Release 13.20 yang merupakan suatu sistem software yang dapat digunakan untuk
melakukan analisis statistik. Data yang diperoleh dianalisis dengan prosedur correlation untuk menghitung koefisien korelasi Pearson antara dua variabel dan signifikansi dari korelasi tersebut dengan persamaan sebagai berikut :
r = Σ xy
√(Σx2)( Σy2)
Keterangan :
r : koefisien korelasi
Σxy : perkalian x dengan y
Σx2 : simpangan setiap x dari rerata x
Σy2 : simpangan setiap y dari terata y
Analisis regresi yang digunakan adalah regresi berganda untuk mengidentifikasi hubungan dan model matematika antara kecepatan pacu/peubah tak bebas (Y) dengan beberapa ukuran tubuh/peubah bebas (X). Hubungan antara peubah-peubah tersebut dapat dituliskan dalam model matematik sebagai berikut :
Yij = a + bxi + cxj (Mattjik 2002)
Keterangan :
Yij : kecepatan pacu
a : konstanta
b : koefisien regresi ukuran tubuh i xi : ukuran tubuh i
c : koefisien regresi ukuran tubuh j xj : ukuran tubuh j
