Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan Februari hingga September 2010 di Laboratorium dan Kandang penelitian Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner serta Laboratorium Patologi, Departemen Klinik Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah hewan coba berupa DOC ayam petelur jantan, ekstrak daun C. siamea, koksidiostat, etanol, propilen glikol, laktosa, kertas saring, pakan ayam yang tidak mengandung kosidiostat, vaksin ND, larutan garam jenuh, NaCl fisiologis, buffer netral formalin 10%, alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 98%, alkohol absolut, xylol, parafin, object glass, larutan lithium karbonat, pewarna hematoxilin eosin (HE), perekat permount, tissue, dan minyak emersi.
Alat yang digunakan adalah mortar, cawan penguap, kandang ayam, kamar penghitung ookista, tissue cassette, automatic tissue processor, pemanas parafin, refrigerator (4-6 °C), mikrotom, inkubator, counter chamber, dan mikroskop cahaya.
Metode Penelitian
Hewan Coba
Penelitian ini menggunakan DOC ayam petelur jantan. Saat ayam berusia 1 minggu diberikan vaksin ND, setelah diberikan vaksin ayam-ayam tersebut
dimasukkan ke dalam kandang berdasarkan kelompok perlakuan. Ayam diberikan pakan dalam bentuk pellet yang tidak mengandung kosidiostat. Minum diberikan ad libitum.
Koksidiostat
Koksidiostat yang digunakan berasal dari golongan sulfonamida
(Colibact® yang diproduksi oleh PT. Sanbe Farma) yaitu sulfadiazine 200 mg dan trimethoprime 40 mg.
Pembuatan Ekstrak daun Cassia siamea Lamk.
Serbuk daun C. siamea kering dimaserasi dengan cara direndam dalam etanol 70% selama 24 jam yang sebelumnya dilakukan pengadukan selama 2 jam. Perbandingan serbuk daun C. siamea kering dan etanol 70% adalah 1 : 10 artinya 1 bagian daun C. siamea (1 kg) dengan 10 bagian etanol (10 liter). Kemudian disaring sehingga diperoleh filtrat pertama dan ampas. Ampas dilarutkan kembali dengan pelarut etanol 70%, diaduk selama 2 jam, didiamkan selama 24 jam atau hingga larutan menjadi bening dan disaring sehingga diperoleh filtrat kedua dan ampas. Filtrat pertama dan filtrat kedua digabung dan dipekatkan dengan rotavapor pada suhu 40-50 °C hingga diperoleh ekstrak kental. Berikutnya ekstrak kental dievaporasi kembali untuk membentuk ekstrak kering daun C. siamea (Kusmardi et al. 2006). Pelarutan ekstrak daun C. siamea dilakukan dengan menggunakan propilen glikol untuk memperoleh dosis bertingkat yaitu dosis rendah (4.09 mg/0.5 ml), dosis sedang (8.18 mg/0.5 ml), dan dosis tinggi (16.38 mg/0.5 ml) dengan bobot badan ayam ± 200 g/ekor (Rama 2008).
Cara perhitungan dosis ekstrak daun C. siamea adalah sebagai berikut: - Dosis standar = 6.79 mg (J2)
- Dosis rendah dan tinggi diperoleh dengan deret hitung sehingga
dosis rendah = ½ x 6.79 mg = 3.395 mg dan dosis tinggi = 2 x 6.79 mg = 13.58 mg
- Ekstrak yang tersedia
- Ekstrak yang dibutuhkan untuk dosis rendah (J1) - Ekstrak yang dibutuhkan untuk dosis sedang (J2)
- Ekstrak yang dibutuhkan untuk dosis tinggi (J3) - Masing-masing dosis C. siamea dilarutkan dalam 0.5 ml propilen glikol
Disain Penelitian
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 6 kelompok perlakuan. Keenam kelompok perlakuan terdiri atas kelompok kontrol negatif (KN), kelompok kontrol positif (KP), kelompok kontrol obat (KO), kelompok yang diberikan ekstrak etanol daun C. siamea dengan dosis rendah (J1),
18
kelompok yang diberikan ekstrak etanol daun C. siamea dengan dosis sedang (J2), dan kelompok yang diberikan ekstrak etanol daun C. siamea dengan dosis tinggi (J3). Kelompok kontrol negatif adalah kelompok ayam yang tidak terinfeksi Eimeria spp. dan tidak diberikan ekstrak etanol daun C. siamea. Kelompok kontrol positif adalah kelompok ayam yang terinfeksi Eimeria spp. dan tidak diberikan ekstrak daun etanol C. siamea. Kelompok kontrol obat adalah kelompok ayam yang terinfeksi Eimeria spp. dan diberikan koksidiostat dengan dosis 0.25 mg/0.5 ml per ekor. Kelompok ayam yang diberikan ekstrak etanol daun C. siamea. dengan dosis rendah adalah kelompok ayam yang terinfeksi
Eimeria spp. dan diberi ekstrak etanol daun C. siamea dengan dosis 4.09 mg/0.5 ml per ekor. Kelompok ayam yang diberikan ekstrak etanol daun
C. siamea dengan dosis sedang adalah kelompok ayam yang terinfeksi Eimeria spp. dan diberi ekstrak etanol daun C. siamea dengan dosis 8.18 mg/0.5 ml per ekor. Kelompok ayam yang diberikan ekstrak etanol daun
C. siamea dengan dosis tinggi adalah kelompok ayam yang terinfeksi Eimeria spp. dan diberi ekstrak etanol daun C. siamea dosis 16.38 mg/0.5 ml per ekor.
Penelitian ini menggunakan 90 ekor DOC ayam petelur jantan. DOC ayam petelur jantan dipelihara pada kandang yang bebas Eimeria spp. hingga ayam berusia 1 minggu. Saat ayam berusia 1 minggu, ayam diberikan vaksin ND. Setelah diberikan vaksin ayam-ayam tersebut dimasukkan ke dalam kandang berdasarkan kelompok perlakuan dan setiap kelompok perlakuan terdiri atas 15 ekor ayam.
Kelompok KN diletakkan pada kandang yang bebas Eimeria spp. sedangkan kelompok perlakuan lain diletakkan pada kandang yang telah terkontaminasi Eimeria spp. Selain kelompok KN, semua ayam ditunggu hingga terinfeksi Eimeria spp. secara alami. Pemeriksaan ookista pada feses ayam dilakukan setiap hari untuk mengidentifikasi adanya infeksi Eimeria spp. dan mengetahui tingkat keparahannya melalui jumlah ookista yang ditemukan pada feses.
Saat ditemukan infeksi Eimeria spp. pada semua ayam kecuali kelompok KN dilakukan pencekokan koksidiostat atau ekstrak daun C. siamea sesuai dengan kelompoknya. Kelompok KN dan kelompok KP tidak dilakukan pencekokan, kelompok KO dilakukan pencekokan dengan Colibact dosis
0.25 mg/0.5 ml per ekor 2 kali sehari, kemompok J1 dicekok dengan ekstrak etanol daun C. siamea dengan dosis 4.09 mg/0.5 ml per ekor 2 kali sehari, kelompok J2 dicekok ekstrak etanol daun C. siamea dengan dosis 8.18 mg/0.5 ml per ekor 2 kali sehari, kelompok J3 dicekok ekstrak etanol daun C. siamea dengan dosis 16.38 mg/0.5 ml per ekor 2 kali sehari. Ekstrak etanol daun C. siamea atau Colibact diberikan pada ayam dengan sistem 3 hari diberikan eksrak etanol daun C. siamea atau Colibact , 3 hari berikutnya tidak diberikan ekstrak etanol C. siamea, 3 hari setelah itu diberikan ekstrak etanol C. siamea atau Colibact
kembali dan dilakukan secara berulang.
Nekropsi dilakukan setelah hari ketiga pencekokan. Nekropsi dilakukan pada setiap kelompok perlakuan, diambil masing-masing organ sekum dari 3 ekor ayam setiap kelompok perlakuan untuk dibuat preparat histopatologi. Bagan pemeriksaan feses, pencekokan dan nekropsi tersaji pada gambar 8.
Usia ayam (hari)
Ayam masuk Vaksinasi ND & pengelompokan
Pemeriksaan feses
Pencekokan Pencekokan
Nekropsi hari ke-0 Nekropsi hari ke-6 Gambar 8 Bagan pemeriksaan feses, pencekokan dan nekropsi.
Infeksi Eimeria spp.
Masing-masing kelompok perlakuan dimasukkan ke dalam kandang yang pernah terinfeksi Eimeria spp. pada periode sebelumnya, ditunggu hingga ayam terinfeksi Eimeria spp. secara alami. Sedangkan kelompok kontrol negatif ditempatkan pada kandang yang bebas Eimeria spp. yaitu kandang yang belum
20
pernah terkontaminasi Eimeria spp. dan tetap dijaga sanitasinya agar terbebas dari Eimeria spp.
Pengamatan ookista
Evaluasi ookista dilakukan dengan cara menimbang 1 gram feses ayam segar dan melarutkannya ke dalam 29 ml larutan garam jenuh hingga homogen. Selanjutnya tabung disentrifus dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Bagian supernatan (permukaan) dari campuran tersebut diambil dengan menggunakan pipet kemudian dimasukkan ke dalam kamar hitung Mc. Master. Pengamatan ini dilakukan setiap hari pada ayam yang sama (Conway & McKenzie 2007).
Pemeriksaan ookista yang ada dalam kamar hitung Mc. Master dilakukan di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 100x (10x lensa objektif dan 10x lensa okuler). Jumlah ookista dari kedua kotak yang terdapat pada kamar hitung Mc. Master dijumlahkan selajutnya dibagi dua. Hasil jumlah rata-rata ookista tersebut lalu dikalikan 200 untuk memperoleh jumlah ookista per gram tinja. Berikut adalah perhitungan faktor pengali ookista.
= 200 x jumlah ookista
Pemeriksaan Histopatologi
Organ sekum dari setiap sampel yang dinekropsi, ditriming dengan tebal ± 0.3 cm, kemudian dimasukkan ke dalam tissue cassette. Jaringan kemudian dihilangkan kandungan airnya dengan dipindah ke dalam alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 98%, alkohol absolut I, alkohol absolut II masing-masing selama 2 jam. Setelah itu dilakukan clearing (penjernihan) dengan memasukkan ke dalam xylol I, xylol II masing-masing selama 2 jam. Lalu diinfiltrasi parafin dengan bantuan alat automatic tissue processor. Tahapan selanjutnya proses embedding, yaitu proses penanaman organ kedalam parafin cair suhu 60 °C dan dibiarkan hingga mengeras dalam cetakan blok parafin. Blok tersebut kemudian disimpan dalam refrigerator (4-6 °C) sebelum diiris dengan mikrotom. Setiap blok parafin diiris menggunakan mikrotom dengan ketebalan 5 mikron. Setelah
dipotong jaringan tersebut diletakkan di atas air hangat agar jaringan tidak mengkerut dan potongan tersebut dilekatkan di atas object glass. Object glass dengan potongan jaringan disimpan didalam inkubator selama ± 24 jam (Staff Patologi 1991).
Proses pewarnaan dilakukan setelah object glass dan potongan jaringan dikeluarkan dari inkubator. Pewarnaan yang digunakan adalah pewarnaan hematoksilin eosin (HE). Pewarnaan HE diawali dengan deparafinisasi, preparat dimasukkan ke dalam larutan xylol I dan xylol II masing-masing selama 2 menit. Proses selanjutnya dehidrasi dengan memasukkan ke dalam alkohol absolut selama 2 menit, alkohol 95% dan alkohol 80%, masing-masing selama 1 menit. Setelah itu preparat dicuci dengan air kran selama 1 menit. Berikutnya dilakukan pewarnaan preparat dengan hematoksilin selama 8 menit kemudian dicuci degan air kran selam 30 detik. Preparat kemudian dicelupkan dalam larutan Lithium carbonat lalu dilakukan pewarnaan dengan eosin selama 2-3 menit. Preparat dimasukkan dalam alkohol absolut I, alkohol absolut II, masing-masing selama 10 celupan. Preparat kemudian dimasukkan ke dalam larutan xylol I selama 1 menit, xylol II selama 2 menit. Tahap akhir preparat ditutup dengan menggunakan cover glass yang telah dilapisi perekat entellan. Pengamatan histopatologi dilakukan dengan mikroskop cahaya. Jumlah sel radang dihitung pada 10 lapang pandang, dan dilakukan terhadap 3 ekor ayam untuk masing- masing perlakuan (Staff Patologi 1991).
Pengolahan data
Pengolahan data dilakukan dengan uji Analysis of Varian (ANOVA)-SPS System kemudian dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Range Test untuk mengetahui perbedaan perlakuan yang diberikan (Mattjik dan Sumertajaya 2002).