Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi dan Biomedis Hewan Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB (BTH-PPSHB) selama bulan Juli 2009 hingga Februari 2010 dan Laboratorium Nutrisi Unggas Fakultas Peternakan selama Maret-April 2010. Analisa energi bruto, kadar mineral Ca, P dan NaCl dilakukan di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor, sedangkan analisa bahan kering, kadar lemak, abu, protein kasar dan serat kasar dilakukan di Laboratorium Biologi Hewan Pusat Antar Universitas Institut Pertanian Bogor (PAU).
Materi Prebiotik
Bahan yang digunakan adalah tongkol jagung varietas SD3, isolat xilanolitik (Streptomyces sp. 234P-16 asal Padang,Streptomyces costaricanus 45I-3 asal Kalimantan yang merupakan koleksi isolat Dr. Ir. Yulin Lestari, Departemen Biologi) dan isolat selulolitik (Actinomyces sp. KBM 6, KBM 7 dan Bacillus sp. C5-1 yang merupakan koleksi Dr. Ir. Anja Meryandini, MS), isolat Escherichia coli
(EPEC K.1.1), hammer milldengan saringan berukuran 40 mesh, oven, shaker incubator(merk Eberbach), sentrifuse (merk Jouan), spektrofotometer, akuades,larutan NaOCl 1%, etanol 70%, asam dinitrosalisilat (DNS), fenol, asam sulfat (H2SO4), akuades, erlenmeyer, gelas ukur, magnetic stirrer, water heater, refrigerator, galon air mineral, aerator dan alat-alat umum laboratorium lainnya.
Pakan
Pakan yang diberikan berupa: (1) Ransum basal yang terbuat dari jagung, dedak, bungkil kedelai, MBM, CPO, DCP, CaCO3, premix, DL-methionine, garam dan L-lysine sebagai pakan kontrol, (2) Ransum basal + antibiotik bambermycin 0,05%, (3) Ransum basal yang ditambah prebiotik 2,5%.Pakan yang dibuat sebanyak 22,5 kg untuk tiga perlakuan. Komposisi bahan pakan dalam ransum basal disajikan dalam Tabel 2, sedangkan kandungan zat makanan (nutrien) dalam ransum penelitian (kontrol, prebiotik dan antibiotik) disajikan dalam Tabel 3.
Tabel 2. Komposisi Bahan Pakan dalam Ransum Basal Bahan Pakan % Jagung Dedak Bungkil kedelai MBM CPO DCP
Kalsium karbonat (CaCO3) Premix DL-methionine Garam L-lysine 63,63 5,59 19,29 5 3,9 0,4 1 0,5 0,18 0,31 0,2 Jumlah 100
Tabel 3. Kandungan Zat Makanan dalam Ransum Penelitian
Kandungan Zat Makanan
Perlakuan Kontrol Bambermycin
(0,05%)
Prebiotik (2,5%)
Energi Brutoa (kkal/kg) 3922 3885 3959
Bahan keringb (%) 83,82 85,44 81,98 Abub (%) 5,24 4,71 6,06 Lemakb (%) 11,39 8,78 9,84 Protein kasarb (%) 23,86 20,19 18,94 Serat kasarb (%) 2,98 3,32 3,44 Caa (%) 1,36 1,3 1,33 Pa (%) 0,66 0,63 0,71 NaCla (%) 0,28 0,18 0,23
Keterangan:Hasil Analisis:a)Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan (2010) dan b) Laboratorium Biologi Hewan PAU (2010).
Ternak
Ternak yang digunakan adalah ayam broiler strain Cobb CP-707 sebanyak 35 ekor yang berumur 5 minggu, sebelumnya digunakan dalam penelitian pendahuluan dan telah diinfeksi E. coli pada umur satu minggu dengan dosis 106 cfu. Penelitian pendahuluan menggunakan tiga perlakuan yaitu kontrol, prebiotik dan antibiotik namun pemberian prebiotik hanya dilakukan sejak hari pertama pemeliharaan hingga
minggu kedua. Tiga puluh ekor ayam akan diberi ransum sesuai perlakuan, sedangkan lima ekor ayam digunakan untuk mengukur energi endogenus.
Kandang
Ayam broiler dipelihara di dalam 35 unit kandang metabolis yang berukuran 35x35x40cm. Tiap kandang dilengkapi peralatan pakan,wadah air minum dan alas plastik penampung ekskreta.
Bahan dan Peralatan lain
Bahan dan peralatan lain yang digunakan yaitu karung tempat ransum, gayung, ember, label, plastik untuk menampung ekskreta, oven 60°C, timbangan, H2SO4 0,01%, plastik tahan panas ukuran 2 kg dan 1 kg, plastik sampel untuk sampel kering, sprayer, alumunium foil, spatula, freezer dan mortar.
Metode Rancangan dan Analisis Data
Penelitian ini terdiri atas enam perlakuan, yaitu: 1. K1 : Ayam tidak diinfeksi E. coli, diberi ransum basal
2. B1 : Ayam tidak diinfeksi E. coli, diberi ransum + antibiotik bambermycin 0,05%
3. P1 : Ayam tidak diinfeksi E. coli, diberi ransum + prebiotik 2,5% 4. K2 : Ayam diinfeksi E. coli, diberi ransum basal
5. B2 : Ayam diinfeksi E. coli, diberi ransum + antibiotik bambermycin 0,05% 6. P2 : Ayam diinfeksi E. coli, diberi ransum + prebiotik 2,5%
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) faktorial 3 x 2, dengan faktor pertama terdiri dari tiga perlakuan yaitu kontrol, antibiotik dan prebiotik, sedangkan faktor kedua terdiri dari dua perlakuan yaitu tanpa dan dengan infeksi E. coli. Masing-masing perlakuan sebanyak 5 ulangan. Model matematik yang digunakan adalah sebagai berikut:
Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + εijk
Keterangan:
µ : Rataan umum dari masing-masing peubah akibat tanpa penambahan bakteri E. coli dan dengan penambahan E. coli dengan perlakuan kontrol, antibiotik dan prebiotik
αi : Pengaruh perlakuan tanpa penambahan E. coli terhadap perlakuan kontrol, antibiotik dan prebiotik
βj : Pengaruh perlakuan dengan penambahan E. coli terhadap perlakuan kontrol, antibiotik dan prebiotik
αβij : Pengaruh interaksi tanpa penambahan E. coli terhadap kontrol, antibiotik, prebiotik dan dengan penambahan E. coli terhadap kontrol, antibiotik dan prebiotik
εijk : Galat akibat pengaruh tanpa penambahan E. coli terhadap perlakuan kontrol, antibiotik dan prebiotikdan dengan penambahan E. coli
terhadap perlakuan kontrol, antibiotik dan prebiotik
Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan sidik ragam (ANOVA) dan apabila terdapat perbedaan yang nyata dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan (Steel dan Torrie, 1997).
Penyiapan Bahan Prebiotik
Tongkol jagung dipotong kecil-kecil hingga berukuran 2x2 cm dan dikeringkan di bawah sinar matahari selama tujuh hari.Selanjutnya tongkol jagung tersebut digiling hingga berukuran 40 mesh.
Tepung tongkol jagung didelignifikasi dengan direndam dalam larutan NaOCl 1% selama 5 jam pada suhu ruang, kemudian tepung tongkol jagung dibilas dengan akuades. Tepung tongkol jagung disaring untuk diambil bagian padatannya yaitu tongkol jagung yang terdelignifikasi, kemudian dikeringkan di bawah matahari selama satu hari.
Peremajaan Isolat dan Penyiapan Inokulum
Isolat-isolat Streptomyces sp. seperti 45I-3 dan 234P-16 diremajakan dalam media agar-agar xilan (Tabel4), keduanya diinkubasi selama empat hingga enamhari pada suhu ruang hingga siap digunakan sebagai inokulum, sedangkanActinomyces sp. KBM 6, KBM 7 danBacillus sp. C5-1 diremajakan dalam media agar-agar CMC
(Carboxymethyl cellulose) (Tabel 4) selama 24-48 jam untuk Bacillus sp. dan empat hingga enam hari untuk Actinomyces sp.
Tabel 4. Komposisi Media Agar-agar Xilan, Media Agar-agar CMC dan Media Tongkol Jagung
Bahan Agar-agar Xilan Agar-agar CMC Tongkol Jagung (g) ---Xilan 0,5 - - CMC - 1 - Tongkol Jagung - - 1 MgSO4.7H2O - 0,02 0,02 KNO3 - 0,075 0,075 K2HPO4 - 0,05 0,05 FeSO4.7H2O - 0,002 0,002 CaCl2 - 0,004 0,004 EkstrakYeast 1 0,2 0,2 Agar 1,6 1,8 - Glukosa - 0,1 0,1 Sukrosa 10,3 - -
Pemilihan Isolat Berdasarkan Nilai Derajat Polimerisasi
Isolat yang sudah diremajakan diinokulasikan ke dalam 100 ml media tongkol jagung 1% (Tabel 4) dengan kombinasi isolat selulolitik dan xilanolitik (Bacillus sp. C5-1 dan Streptomyces sp. 234P-16, Actinomyces sp. KBM 6 dan
Streptomyces costaricanus45I-3, serta Actinomyces sp.KBM 7 dan Streptomyces costaricanus 45I-3). Sebanyak 3 cockborer berukuran diameter 1 cm masing-masing isolat (masing-masing-masing-masing KBM 6, KBM 7 dengan 45I-3 dan C5-1 dengan 234P-16) diinokulasikan ke dalam 100 ml media produksi dari tongkol jagung 1% (Tabel 4) dan diinkubasi diatas shaker incubator sesuai syarat optimumnya (Tabel 5).
Tabel 5. Data Optimum Kombinasi Isolat Bakteri
Kombinasi Bakteri Suhu Optimum pH Optimum Hari Optimum
C5-1 dan 234P-16 90°C 3,5 6
KBM 6 dan 45I-3 50°C 5,5 3
KBM 7 dan 45I-3 50°C 5,5 3
Ekstrak kasar xilanase dan selulase dipanen pada hari optimum dengan cara mensentrifugasi kultur dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu 4ºC selama 25 menit. Supernatan (ekstrak kasar enzim) diukur aktivitasnya pada pH dan suhu optimum masing-masing isolat tersebut.
Aktivitas xilanase dan selulase diukur sebagai pembentukan gula pereduksi dengan menggunakan metode DNS. Kandungan total gula tongkol jagung dapat diukur dengan metode fenol asam sulfat dan derajat polimerisasi dihitung berdasarkan perbandingan antara total gula dengan gula pereduksi yang dihasilkan.
Enzim xilanase dan selulase yang dihasilkan dicampur dengan substrat tongkol jagung 1% (tongkol jagung sebanyak 1 gram yang dimasukkan ke dalam 100 ml buffer pH optimum enzim), dengan perbandingan konsentrasi enzim dan substrat yaitu 1:2,5, 1:5 dan 1:7,5. Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu optimum masing-masing kombinasi enzim. Selanjutnya kultur disentrifugasi untuk mendapat enzim ekstrak kasar dan diukur gula pereduksi, total gula dan derajat polimerisasi. Dari ketiga kombinasi tersebut dipilih satu kombinasi isolat yang memiliki derajat polimerisasi yang paling baik yaitu antara 2-20 untuk dibuat prebiotik.
Penentuan Total Gula
Penentuan total gula dilakukan dengan metode fenol-sulfat, yaitu mengambil 2 ml supernatan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 1 ml larutan fenol 5%, dikocok, dan ditambahkan 5 ml H2SO4 pekat. Selanjutnya larutan dibiarkan selama 10 menit, dikocok kembali dan diukur menggunakan spektrofotometer pada λ = 490 nm. Nilai absorbansi yang dihasilkan kemudian dimasukkan ke dalam persamaan linear dari kurva standar total gula.
Penentuan Gula Pereduksi Metode DNS
Penentuan Gula Pereduksi dilakukan dengan menggunakan metode Miller (1959) yang melibatkan terukurnya gula pereduksi oleh larutan DNS (Tabel 6). Metode DNS tersebut yaitu dengan cara mengambil 1 ml supernatan, setelah itu ditambah DNS sebanyak 1 ml, kemudian dilanjutkan pemanasan pada suhu 100°C selama 15 menit. Selanjutnya diukur Optical Density (OD) warna yang dihasilkan akibat percampuran gula pereduksi dengan larutan DNS pada spektro dengan λ = 540 nm. Nilai absorbansi yang dihasilkan kemudian dimasukkan ke dalam persamaan linear dari kurva standar gula pereduksi.
Tabel 6. Komposisi Reagen Asam dinitrosalisilic acid (DNS)
Bahan Jumlah NaOH padat 10 g KNa Tartrat 182 g Na2SO3 10 g DNS 10 g Aquades 1000 ml Pembuatan Prebiotik
Bakteri yang sudah diremajakan pada media agar-agar CMC (bakteri selulolitik) dan media agar-agar xilan (bakteri xilanolitik) diinokulasikan masing-masing sebanyak tiga cockborer ke dalam 100 ml media cair CMC untuk bakteri selulolitik dan 100 ml media cair xilan untuk bakteri xilanolitik, kemudian diinkubasi pada shaker incubator selama tiga hari. Masing-masing kultur sel diambil sebanyak 10 ml, kemudian dimasukkan ke dalam 100 ml media tongkol jagung 1% dan diinkubasi pada shaker incubator selama 7 hari. Setelah diinkubasi, kemudian diinokulasikan pada media bervolume 10 liter media tongkol jagung 1%, lalu diinkubasi selama 10 hari menggunakan aerator.
Supernatan yang diperoleh berupa prebiotik yang kemudian diukur peningkatan gula pereduksi dengan metode DNS, kandungan total gula tongkol jagung diukur dengan metode fenol asam sulfat dan derajat polimerisasi dihitung berdasarkan perbandingan antara total gula dengan gula pereduksi yang dihasilkan.
Setelah gula pereduksi dan gula total diukur, supernatan yang diperoleh dipekatkan dengan cara dididihkan dengan api kecil-sedang hingga tercapai densitas yang tinggi (pekat dan kental). Supernatan yang pekat kemudian diukur total gula dan gula pereduksi, agar mengetahui perubahan total gula yang terjadi. Setelah diukur, supernatan yang dihasilkan dimasukkan ke dalam kantong plastik tahan panas, kemudian dimasukkan ke dalam freezer untuk mencegah menurunnya kualitas prebiotik.Prebiotik yang dihasilkan sebanyak 1 liter dengan total gula setara 384,088 gram.Salah satu tahapan dalam pembuatan prebiotik, yaitu pemekatan dengan metode pendidihan dapat dilihat pada Gambar 7.
Gambar 7. Proses Pembuatan Prebiotik
Pembuatan Pakan
Total pakan perlakuan prebiotik yang dibuat untuk 30 ekor selama lima hari perlakuan adalah 22,5kg (7500 g untuk masing-masing perlakuan pakan atau 750 g untuk masing-masing ayam). Prebiotik yang dicampurkan sebanyak 2,5% sehingga prebiotik yang diperlukan sebanyak 187,5 gram atau 48,82% dari total volume prebiotik sebanyak 1000 ml. Dari angka tersebut, volume prebiotik yang dicampurkan ke dalam ransum adalah sebanyak 488,2 ml atau setara dengan 187,5 gram prebiotik xilooligosakarida. Prebiotik tersebut dicampurkan langsung pada saat proses pembuatan ransum.
Pakan untuk perlakuan penelitian dicampur dengan menggunakan tangan.Seluruh bahan yang ada (kecuali antibiotik bambermycin dan prebiotik) dicampurkan menjadi satu.Setelah itu, pakan yang telah jadi dibagi menjadi tiga, untuk perlakuan kontrol, bambermycin dan prebiotik.Pakan tanpa penambahan bambermycin atau prebiotik, digunakan sebagai pakan kontrol. Pada perlakuan antibiotik, pakan yang sebelumnya telah dibuat ditambahkan bambermycin sebanyak 0,05% dan dicampurkan hingga rata. Penggunaan dosis antibiotik bambermycin
sebanyak 0,05% adalah dosis pencegahan terhadap infeksi bakteri, diharapkan dengan pemberian antibiotik dosis tersebut dapat membantu memulihkan kondisi ayam broiler pasca infeksi E. coli.
Untuk perlakuan prebiotik, supernatan yang telah pekat (kental) dicampurkan ke pakan. Karena kadar air dalam pakan perlakuan prebiotik masih tinggi akibat kandungan air dalam prebiotik, pakan dimasukkan ke dalam oven 60°C selama 2-3 hari hingga kadar air pakan menurun.
Persiapan Kandang Metabolis
Sebelum penelitian dimulai, kandang metabolis dan peralatan yang digunakandibersihkan dan disucihamakan. Ayam-ayam yang akan digunakan dalam percobaan ini diistirahatkanuntuk masa prelim sebelum perlakuan diberikan.
Sebelum ayam ditempatkan dalam kandang metabolis, ayam ditimbang untuk mengetahui bobot badan awal.Kemudian ayam terlebih dahulu dipuasakan selama 24 jam dari ransum untuk mengosongkan isi saluran pencernaan, sehingga ekskreta yang dihasilkan pada saat koleksi seluruhnya berasal dari pakan perlakuan yang diberikan setelah proses pemuasaan. Air minum diberikan ad libitum.Lima ekor ayam dipuasakan kembali untuk mendapatkan nilai energi dan nitrogen endogenus.
Tahap Pelaksanaan Percobaan
Infeksi E.coli dilakukan pada umur satu minggu. Infeksi E.coli dilakukan secara dicekok langsung pada ayam broiler dengan dosis 106cfu/ml (cfu: colony forming unit) sebanyak 100µm. Penantangan E. coli diberikan kepada15 ayam broiler yang dibagi ke dalam 3 perlakuan, masing-masing terdiri dari 5 ulangan dan setiap ulangan menggunakan 1 ekor ayam.
Ayam ditimbang untuk mengetahui bobot awal sebelum puasa, kemudian ayam dipuasakan selama 24 jam dan air minum tetap diberikan (untuk ayam endogenus, dipuasakan selama 2 x 24 jam).Setelah masa pemuasaan, ayam broiler diberikan ransum sesuai perlakuan sebanyak 150 g/hari/ekor dan air minum ad libitumselama lima hari. Selama perlakuan, ekskreta disemprot H2SO4 konsentrasi rendah (0,01 N) setiap beberapa jam sekali untuk mengikat N agar tidak menguap. Setelah 24 jam, ekskreta basah dari setiap perlakuan, baik perlakuan kontrol, antibiotik, prebiotik termasuk perlakuan untuk pengukuran energi endogenus yang
diperoleh, dimasukkan ke plastik untuk kemudian ditimbang dan dimasukkan ke dalam freezer untuk mencegah aktivitas dekomposisi oleh mikroorganisme. Kolekting ekskreta ini dilakukan selama lima hari.
Analisis Ekskreta
Setelah diambil dari freezer, ekskreta dibiarkan dalam suhu ruangan sampai mencair (proses thawing) kemudian dikeringkan dalam oven bersuhu 60°C selama kurang lebih 24-48 jam. Ekskreta yang telah kering dihaluskan dengan menggunakan blender sehingga bentuk fisiknya halus seperti tepung. Analisis kandungan energi bruto ekskreta dan ransum perlakuan dilakukan dengan menggunakan bom kalorimeter oksigen, sedangkan analisis kandungan nitrogen menggunakan metode Kjeldahl.
Peubah yang Diamati
Peubah yang diamati dalam penelitian ini adalah konsumsi pakan, konsumsienergi, ekskresi energi, konsumsi nitrogen, ekskresi nitrogen, retensi nitrogen, energi metabolis semu (EMS), energi metabolis murni (EMM), energi metabolis semu terkoreksi N (EMSn), energi metabolis murni terkoreksi N(EMMn). 1. Konsumsi Pakan
Konsumsi pakan didapatkan dengan mengurangi antara bobot ransum yang diberikan per harinya dengan bobot sisa ransum di hari berikutnya.
Konsumsi Pakan (g) = Bobot ransum yang diberikan (g) - bobot ransum sisa (g)
2. Konsumsi Energi
Konsumsi energi diperoleh dengan mengalikan jumlah bahan pakan perlakuan yang dikonsumsi dengan kandungan energinya.
Konsumsi Energi (kkal) = Konsumsi ransum (g) x Energi bruto ransum (kkal/g)
3. Ekskresi Energi
Ekskresi energi diperoleh dengan mengalikan berat ekskreta setelah dikeringkan dalam oven 60°C dengan kandungan energinya.
4. Konsumsi Nitrogen
Nilai ini diperoleh dengan cara mengalikan jumlah konsumsi bahan pakan dengan kandungan protein kasar bahan pakan perlakuan (yang dianalisis dengan metode Kjeldahl) lalu dibagi 6,25.
5. Ekskresi Nitrogen
Ekskresi Nitrogen diperoleh dengan mengalikan jumlah ekskreta dengan kandungan protein kasar pada ekskreta.
6. Retensi Nitrogen
Retensi nitrogen dalam satuan gram diperoleh dengan cara mengurangi jumlah konsumsi nitrogen dengan hasil ekskresi nitrogen yang telah dikoreksi dengan N endogenus yang diperoleh dari koleksi ekskreta pada lima ekor ayam yang dipuasakan dari ransum. Retensi nitrogen dalam satuan persen diperoleh dengan membagi antara retensi nitrogen dalam satuan persen dengan konsumsi nitrogen. Retensi N (g) = Konsumsi N (g) - [Ekskresi N (g) - Ekskresi N endogenus (g)]
7. Energi Metabolis
a. Energi Metabolis Semu (EMS)
b. Energi Metabolis Murni (EMM)
d. EMM terkoreksi N (EMMn)
Keterangan:
X = Bobot ransum yang dikonsumsi (kg) EBp = Energi bruto ransum (kkal/kg) Y = Bobot ekskreta (kg)
EBe = Energi bruto ekskreta (kkal/kg) Z = Bobot ekskreta endogenus (kg)
EBk = Energi bruto ekskreta endogenus (kkal/kg) RN = Retensi Nitrogen (kg)
HASIL DAN PEMBAHASAN