Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan diLaboratorium Fisiologi, Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor (FKH IPB), serta kandang hewan percobaan yang terletak di Unit Rehabilitasi dan Reproduksi (URR), Departemen Klinik Reproduksi dan Patologi FKH IPB. Pengukuran diameter sel darah dilakukan di Laboratorium Helminthologi, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat FKH IPB. Penelitian ini berlangsung dari bulan September 2010-Juli 2011.
Materi Penelitian
Jumlah landak yang digunakan dalam penelitian ini 5 ekor landak Jawa (Hystrix javanica) dewasa yang memiliki bobot badan antara 7-9 kg. Landak terdiri dari4 ekor landak jantan (A, B, C, dan E) dan1 ekor landakbetina (D). Landak dipelihara dan telah diaklimatisasikan dengan baik pada lingkungan kandang.
Bahan yang dipergunakan adalah darah landak, cairan pengencer eritrosit (Hayem), cairan pengencer leukosit (Turk), HCl 0.1 N, aquades, alkohol 70%, metil alkohol (pewarnaan Giemsa), antikoagulan (EDTA), dan obat biusyaitu silazinHCldan ketamin HCl.
Peralatan yang digunakan adalah kandang, spuit dengan jarum tuberkulin, pipet pengencer eritrosit dan leukosit, kamar hitung, mikroskop, kertas saring, alat penghitung, tabung kapiler, alat penyumbat tabung kapiler, alat sentrifuse, alat pembaca mikrohematokrit, kapas, batang kaca pengaduk, kaca preparat,tabung Sahli, dan spektofotometer sebagai alat pengukur sel-sel darah.
Metode Penelitian
Kegiatan penelitian terdiri dari: pembiusan dan pengambilan darah; pengamatan bentuk dan ukuran dari masing-masing sel darah serta diferensiasi leukosit melalui pembuatan preparat ulas darah dan pewarnaan Giemsa;
penghitungan jumlah eritrosit dan leukosit; penentuan hematokrit secara mikro;dan penentuan kadar hemoglobin.
Pembiusan dan pengambilan darah
Obat bius yang digunakan adalah kombinasi silazin HCl 2% dan ketamin HCl 10% IM. Dosis yang digunakan pada obat bius adalah silazin HCL 2 mg/kg BB dan ketamin HCl5 mg/kg BB. Obat bius disuntikkan secara intramuskular/IM di bagian dorsal pangkal ekor landak (Morin dan Bertaux 2003). Pengambilan darah dilakukan sebanyak 2 kali dalam rentang waktu3 bulan, dengan menggunakan pole syringeyang telah dibilas dengan EDTAsebagai anti koangulan. Pengambilan darah dilakukan secaraintracardialpada saat landak dalam kondisi terbius. Penyuntikan dilakukan di daerahintracostaeyang sejajar dengan olecranon(Gambar 4). Darah yang diperoleh selanjutnya diperiksa dengan berbagai uji hematologi.
Gambar 4 Proses pengambilan darah.
Pengambilan darah dilakukansecara intracardial didaerahintercostaeyang sejajar dengan olecranon.
Pembuatan preparat ulas darah
Darah diteteskan pada satu sisi kaca preparat, kemudian salah satu sisi ujung kaca preparat lain ditempelkan pada permukaan kaca preparat pertama dengan membentuk sudut 30-45 derajat. Kaca preparat kedua didorong sepanjang permukaan kaca preparat pertama dengan cukup cepat sehingga terbentuk lapisan darah yang tipis dan merata, lalu preparat dikeringkan.
Pewarnaan Giemsa pada preparat ulas darah
Setelah dibuat preparat ulas maka dibuat pewarnaan Giemsa. Sebelum dilakukan pewarnaan Giemsa, preparat ulas darah dimasukkan kedalam metil alkohol (cawan pewarnaan) dan dibiarkan selama 5 menit, lalu dikeringkan. Preparat ulasselanjutnya dicelupkan ke dalam larutan pewarnaan Giemsa selama 15-60 menit. Preparat dicuci dengan menggunakan air dan dikeringkan di udara. Preparat siap untuk diperiksa di bawah mikroskop dimulai dengan perbesaran rendah (obyektif 10 kali). Untuk pengamatan diferensiasi leukosit dan pengukuran diameter sel-sel darah, digunakan perbesaran yang lebih tinggi yaitu 40 kali atau 100 kali dengan bantuan minyak emersi, kemudian dilakukan pengamatan morfologi dan pengukuran pada masing-masing sel darah dengan menggunakan alat spektofotometer.
Penghitungan jumlah eritrosit dan leukosit
Darah diambil dengan menggunakan pipetpengencer eritrosit hingga batas angka 0.5-1.0, kemudianujung pipet dicelupkan kedalam cairan pengencer (Hayem) dan cairan diambil sampai batas tanda tera 101. Pipet diangkat, lalu ditutup ujungnya dengan ibu jaridan pangkalnya ditutup dengan jari tengah pada posisi pipet mendatar. Penghomogenan dilakukan dengan gerakan bolak-balik seperempat lingkaran atau gerakan angka delapan mendatar. Selanjutnya darah yang larut dalam pengencer eritrosit dimasukkan ke dalam kamar hitung Burker dan ditutup dengan kaca penutup. Kamar hitung didiamkan dengan posisi mendatar selama beberapa menit agar sel-sel darah merah mengendap sempurna. Setelah itu, kamar hitung diletakkan dimeja mikroskop untuk diamati. Eritrosit dihitung, yaitu 5 kotakpada kamar hitung seperti tertera pada Gambar 5. Ketentuan dalam perhitungan yaitusel-sel yang menyentuh garis atas dan kiri kotak dihitung, sedangkan sel-sel yang menyentuh garis batas kedua sisi lainnya (kanan dan bawah) tidak dihitung. Total hasil yang diperoleh dari jumlah perhitungan sel eritrosit akhir (n butir) dikalikan 10.000 per mm3.
Perhitungan jumlah leukosit padaprinsipnyasama dengan perhitungan jumlah eritrosit, yang membedakan adalah jenis pipet pengencer, cairan pengencer, dan ruang hitungnya. Pada proses perhitungan jumlah leukosit, yaitu darah diambil sampai tanda 0.5-1.0 pada pipet pengencer leukosit. Kemudian
larutan pengencer Turk dihisap sampai tanda 11 pada ujung pipet. Leukosit dihitung, yaitu 4 kotakpada kamar hitung seperti tertera pada Gambar 5. Hasil perhitungan akhir yaitu jumlah seluruh sel leukosit dari 4 kotak tersebut (n butir) dikalikan 50 per mm3.
Gambar 5 Kamar hitung Burker.
Keterangan: kotak R untuk menghitung sel eritrosit, kotak W untuk menghitung sel leukosit.
Penentuan hematokrit cara mikro
Darah diambil dengan tabung kapiler dengan cara menyentuhkan tabung pada darah. Bagian ujung tabung disumbat dengan alat penyumbat tabung khusus. Selanjutnya tabung kapiler diletakkan pada alat sentrifuse dengan bagian tidak tersumbat diarahkan ke pusat sentrifuse. Sentrifugasi dilakukan selama5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm.Kemudian tabung kapiler siap dibaca dengan menggunakan alat mikrohematocrite reader.
Penentuan kadar hemoglobin
Penentuan kadar hemoglobin dilakukan dengan menggunakan tabung Sahli. Tabung Sahli diisi dengan HCl 0.1 N sampai garis terbawah (tanda 20mm3). Darah diambil dengan pipet hemoglobin sampai tanda 20 mm3. Kemudian darah dimasukkan ke dalam tabung Sahli dengan meniup secara perlahan-lahan. Pencampuran dilakukan dengan menghisap dan meniupkan secara perlahan-lahan. Terbentuknya asam hematin ditandai dengan adanya perubahan warna menjadi coklat atau coklat hitam. Kemudian aquades diteteskan beberapa tetes sambil dikocok sampai warnanya sama dengan warna pembanding. Hasil yang diperoleh yaitu dengan melihat meniskus bawah cairan pada tabung Sahli. Satuan hemoglobin dinyatakan dengan gram %.