Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian Pemuliaan Genetika, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian berlangsung selama sembilan bulan dimulai pada Oktober 2010 sampai Juni 2011.
Materi dan Alat Penelitian
Materi penelitian yang digunakan untuk analisis DNA adalah koleksi sampel sapi Bali (Bali), Madura (Pulau Madura), Pesisir (Sumatera Barat), Katingan (Kalimantan Tengah), Limousin dan Simmental yang terdapat di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Fakultas Peternakan IPB. Sampel ternak, jumlah dan asal ternak sapi yang digunakan dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Sampel, jumlah dan asal sapi yang digunakan dalam penelitian
No. Sampel Sapi Tahun Koleksi Jumlah Asal
1. 2. 3. 4. 5. 6. Bali Madura Pesisir Katingan Simmental Limousin 2009 2011 2004 2010 2006 2006 20 20 20 20 10 10
UP3 dan BIBD Bali Pulau Madura Sumatera Barat Kalimantan Tengah BIB Singosari Malang BIB Singosari Malang
Total 100
Isolasi DNA
Isolasi DNA menggunakan beberapa bahan atau pelarut seperti Tris- EDTA konsentrasi rendah (low TE), etanol absolut, etanol 70%, dan larutan pengencer DNA (Master mix) 1x. Peralatan yang digunakan untuk isolasi DNA adalah pipet tip Eppendorf, mikro pipet 200 P, 1000 P Gilson, microtube eppendorf ukuran 1.5 ml, mikrosentrifuge, inkubator dan vortex.
Analisis PCR
Beberapa bahan yang digunakan untuk PCR adalah destilated water, DNA, primer forward dan reverse fragmen gen GH exon 1– exon 5 berdasarkan Lagziel et al. (1996) dan Kioka et al. (1989), beberapa pereaksi PCR yang terdiri atas enzim Tag DNA polymerase 5 unit/µl, bufer thermophilic DNA polymerase
10x reaksi bebas MgCl2 25 mM dan campuran nukleotida 40 nM (masing-masing
10 mM dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP). Peralatan yang digunakan dalam analisis PCR adalah pipet tip Eppendorf, mikropipet 10 P, 20 P, 200 P Gilson,
microtube, dan mesin PCR (eppendorf 5332) serta stabilizer.
Analisis Elektroforesis
Teknik elektroforesis gel poliakrilamida (PAGE) digunakan untuk menguji ada tidaknya produk PCR dilakukan dengan 6-12 % dalam buffer 0.5 x TBE (Tris 0.5 M, asam borat 0.65 M dan EDTA 0.02 M). Elektroforesis dijalankan pada kondisi 200 V selama 1 jam (Zhao et al. 2004). Visualisasi produk PCR dilakukan dengan pewarnaan sensitif perak mengikuti motede Tegelstrom (1986) dan Byun et al. (2009) yang dimodifikasi. Peralatan yang digunakan untuk elektroforesis adalah pipet tip Eppendorf, mikro pipet 10 P Gilson, gelas ukur, electrophoresis (BIO-RAD machine), power supply.
Metode Penelitian Isolasi DNA Total
Isolasi DNA dilakukan dari sampel darah yang disimpan dalam alkohol. Ekstraksi DNA menggunakan metode Fenol kloroform berdasarkan Sambrook et al. (1989) yang dimodifikasi untuk penggunaan sampel darah yang disimpan dalam alkohol (Lampiran 2).
Amplifikasi Gen GH
Amplifikasi fragmen gen GH dilakukan dengan menggunakan 10 set primer dengan mesin PCR. Bahan pereaksi yang digunakan untuk PCR adalah DNA, buffer 10x, 10 mM dNTP, 50 mM MgCl2, primer Forward dan Reverse
masing-masing 30 pmol, dan 2.5 unit Tag DNA Polymerase (Dream taq Fermentas) dengan total volume reaksi 12 l. Adapun komposisi bahan untuk
volume reaksi 12 l adalah 5 l buffer PCR 10x bebas MgCl2, 2 l MgCl2, 1 l
dNTP, 1.5 l masing-masing primer Forward dan Reverse, 1.5 l sampel DNA, dan 0.25 l enzim Tag DNA Polymerase dan sisanya deionized water 37.25 l. Sebelum bahan-bahan tersebut dimasukkan ke dalam mesin PCR, terlebih dahulu diputar sebentar (spin down) dengan mikro sentrifuge. Primer yang digunakan yaitu primer forward dan primer reverse, seperti yang terlihat pada Tabel 2. Tabel 2. Posisi, panjang fragmen dan sekuens primer yang digunakan untuk
mengamplifikasi gen GH
Exon Panjang fragmen (pb) dan lokasi Sekuens primer 1 2 3 4 5 315 444 - 759 283 999 - 1282 158 1341 - 1499 198 1693 - 1892 392 2089 – 2481
F μ 5’-TGG TGG CAG TGG AGA CGG GA-3’* R μ 5’-GGA CAC GCG AAT GGA GGG GA-3’* F μ 5’-GCC CTG CTC TGC CTG CCC TG-3’* R μ 5’-CCC CAC ACA CCC CCG TTT CT-3’*
F μ 5’-GTG TGT TCT CCC CCC AGG AG-3’#
R μ 5’-CTC GGT CCT AGG TGG CCA CT-3’#
F μ 5’-GGA AGG GAC CCA ACA ATG CCA-3’#
R μ 5’-CTG CCA GCA GGA CTT GGA GC-3’#
F μ 5’-GCT GCT CCT GAG GGC CCT TC-3’*
R μ 5’-CCA CCC CAC CCC CCA GAA TA-3’* Ket : * = sekuens primer Lagziel et al. (1996) yang telah dimodifikasi.
# = sekuens primer Kioka et al. (1989).
Kelima primer tersebut memiliki polimorfisme tinggi terhadap gen GH. Kondisi mesin PCR dilakukan dengan denaturasi awal pada suhu 95ºC selama 5 menit, 35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 95ºC selama 45 detik, penempelan primer pada suhu 60º–66ºC selama 45 detik dan ekstensi DNA baru pada suhu 72ºC selama 1 menit, dan ekstensi akhir pada suhu 72ºC selama 5 menit.
Sekuens gen GH dengan panjang produk PCR 2856 pb dari exon 1 sampai
exon 5 (Gordon et al. 1983) disertai dengan penempelan kelima primer dari Lagziel et al. (1996) dan Kioka et al. (1989) yang telah dimodifikasi. Runutan primer Forward dan Reverse dapat dilihat pada Gambar 7.
1 gtactggggt gggttgcctt tctcttctcc aggggattta tctgacccag ggattgaacc 61 tgagtctcct gcatttgcag ctagattctt tacggctgag ccacctggga agcccattcg 121 cttctgctgc tgctgctgct gctaagttgc ttcagtcgtg tccgacctgt gcgacgccat 181 agacagcagc ccaccaggtc cccgtccctg ggattctcca ggcaagaaca ttggagtggg 241 ttgccatttc ctcctccaat gcatgaaagt gaaaagtgaa agtgaagtca ctcagttgtg 301 tccgaccctc agcgacccca tggactgcag ccttccagaa tggggtgcca ttgccttctc 361 ctcgcttctg ctacctcccc tttaaaaaga aaacctatgg ggtgggctct caagctgaga 421 ccctgtgtgc acagccctct ggctggtggc agtggagacg ggatgatgac aagcctgggg 481 gacatgaccc cagagaagga acgggaacag gatgagtgag aggaggttct aaattatcca 541 ttagcacagg ctgccagtgg tccttgcata aatgtataga gcacacaggt ggggggaaag 601 ggagagagag aagaagccag ggtataaaaa tggcccagca gggaccaatt ccaggatccc 661 aggacccagt tcaccagacg actcagggtc ctgtggacag ctcaccagct atgatggctg 721 caggtaagct cgctaaaatc ccctccattc gcgtgtccta aaggggtaat gcggggggcc 781 ctgccgatgg atgtgttcag agctttgggc tttagggctt ccgaatgtga acataggtat 841 ctacacccag acatttggcc aagtttgaaa tgttctcagt ccctggaggg aagggtaggt 901 ggggctggca ggagatcagg cgtctagctc cctggggccc tccgtcgcgg ccctcctggt 961 ctctccctag gcccccggac ctccctgctc ctggctttcg ccctgctctg cctgccctgg 1021 actcaggtgg tgggcgcctt cccagccatg tccttgtccg gcctgtttgc caacgctgtg 1081 ctccgggctc agcacctgca tcagctggct gctgacacct tcaaagagtt tgtaagctcc 1141 cgagggatgc gtcctagggg tggggaggca ggaaggggtg aatccacacc ccctccacac 1201 agtgggagga aactgaggag ttcagccgta ttttatccaa gtagggatgt ggttagggga 1261 gcagaaacgg gggtgtgtgg ggtggggagg gttccgaata aggcggggag gggaaccgcg 1321 caccagctta gacctgggtg ggtgtgttct tcccccagga gcgcacctac atcccggagg 1381 gacagagata ctccatccag aacacccagg ttgccttctg cttctctgaa accatcccgg 1441 cccccacggg caagaatgag gcccagcaga aatcagtgag tggcaacctc ggaccgagga 1501 gcaggggacc tccttcatcc taagtaggct gccccagctc ccgcaccggc ctggggcggc 1561 cttctccccg aggtggcgga ggttgttgga tggcagtgga ggatgatggt gggcggtggt 1621 ggcaggaggt cctcgggcag aggccgacct tgcagggctg ccccagaccc gcggcaccca 1681 ccgaccaccc acctgccagc aggacttgga gctgcttcgc atctcactgc tcctcatcca 1741 gtcgtggctt gggcccctgc agttcctcag cagagtcttc accaacagct tggtgtttgg 1801 cacctcggac cgtgtctatg agaagctgaa ggacctggag gaaggcatcc tggccctgat 1861 gcgggtgggg atggcgttgt gggtcccttc catgtggggg ccatgcccgc cctctcctgg 1921 cttagccagg agaatgcacg tgggcttggg gagacagatc cctgctctct ccctctttct 1981 agcagtccag ccttgaccca ggggaaacct tttccccttt tgaaacctcc ttcctcgccc 2041 ttctccaagc ctgtagggga gggtggaaaa tggagcgggc aggagggagc tgctcctgag 2101 ggcccttcgg cctctctgtc tctccctccc ttggcaggag ctggaagatg gcaccccccg 2161 ggctgggcag atcctcaagc agacctatga caaatttgac acaaacatgc gcagtgacga 2221 cgcgctgctc aagaactacg gtctgctctc ctgcttccgg aaggacctgc ataagacgga 2281 gacgtacctg agggtcatga agtgccgccg cttcggggag gccagctgtg ccttctagtt 2341 gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc 2401 ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt 2461 ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca 2521 ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg gtacccaggt gctgaagaat tgacccggtt 2581 cctcctgggc cagaaagaag caggcacatc cccttctctg tgacacaccc tgtccacgcc 2641 cctggttctt agttccagcc ccactcatag gacactcata gctcaggagg gctccgcctt 2701 caatcccacc cgctaaagta cttggagcgg tctctccctc cctcatcagc ccaccaaacc 2761 aaacctagcc tccaagagtg ggaagaaatt aaagcaagat aggctattaa gtgcagaggg 2821 agagaaaatg cctccaacat gtgaggaagt aatgag
Keterangan : huruf tebal situs primer (forward – reverse).
Gambar 7. Posisi penempelan primer (cetak tebal) pada sekuen gen GH (nomor akses M57764).
Elektroforesis dan Visualisasi DNA
Teknik elektroforesis gel poliakrilamida (Polyacrilamide gel (PAGE)) digunakan untuk menguji ada tidaknya produk PCR dilakukan dengan dalam
buffer 0.5 x TBE (Tris 0.5 M, asam borat 0.65 M dan EDTA 0.02 M). Elektroforesis dijalankan pada kondisi 200 V selama ± 2 jam. Visualisasi pola pita hasil SSCP dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid 6% yang diikuti dengan metode pewarnaan perak (silver stainning) menurut
Exon 1
Exon 2
Exon 3
Exon 4
petunjuk Tegelstrom (1986) yang telah dimodifikasi. Tahapan pewarnaan perak (silver staining) yaitu gel dicuci secara bertahap sebagai berikut: dengan larutan AgNO3 0.2 gram, 80 µl NaOH 10 N, 800µl ammonia dalam 200 ml air destilasi
selama 8 menit, kemudian dibilas dengan air destilasi selama 2 menit. Memunculkan pita dalam gel dimulai dengan merendam gel dalam larutan yang terdiri atas 3.6 gram NaOH, 1.6 gram NaCO3, 200 ml air destilata dan 200 µl
formaldehid selama 6 menit selanjutnya ditambah. Setelah pita muncul, larutan asam asetat ( 100 ml air destilasi dan 100 µl asam asetat) dituangkan untuk menghentikan aktifitas oksidasi perak oleh formaldehid.
Pendeteksian Varian Gen GH dengan Metode PCR-SSCP
Produk PCR yang dianalisis dengan metode SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) dimanfaatkan untuk pendeteksian adanya mutasi pada ruas exon dan intron produk gen GH (Lagziel et al. 1996). Produk PCR yang didapatkan kemudian diidentifikasi konformasi DNA utas tunggal (single strand conformational), maka sekitar 12 l produk PCR dicampur dengan 12 l loading dye (98% formamide, 10 mM EDTA,0.025% bromophenol blue, 0.025%
xylene-cyanol), dan setelah didenaturasi pada suhu 95 oC selama 5 menit, sampel langsung didinginkan dengan es batu selama 3 menit dan diloading pada gel
poliacryalmide 12-10% untuk setiap fragmen. Penggunaan teknik perendaman produk PCR di dalam waterbath dan icebath tersebut, memungkinkan DNA yang sudah terdenaturasi menjadi utas tunggal tidak kembali menjadi utas ganda lagi. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan Protean II xi cells (Bio-Rad) pada kondisi 200-300 V pada suhu 5oC selama 8-14 jam pada larutan buffer 0,5x TBE. Setelah elektroforesis gel kemudian diwarnai dengan metode silver staining (Byun et al. 2009) dan Tegelstrom (1986) yang dimodifikasi.
Deteksi untai tunggal diuji dengan gel poliakrilamida (PAGE) 10-12 % yang merupakan campuran akrilamid dengan bis akrilamid dengan perbandingan 29 : 1. Selanjutnya elektroforesis dijalankan pada kondisi 200-350 V selama 8–14 jam pada suhu 40C yang dilanjutkan dengan pewarnaan perak.
Perbedaan laju migrasi dan perbedaan jumlah pita yang muncul pada gel poliakrilamida (PAGE) dari setiap sampel menandakan terjadinya perubahan pada
nukleotida DNA untai tunggal. Berdasarkan perbedaan laju migrasi dan jumlah pita yang muncul maka keragaman tipe gen GH dapat ditentukan. Genotiping hasil SSCP berdasarkan pola pita yang muncul pada gel acrilamide yang telah diwarnai (Malveiro et al. 2001).
Analisis Data Frekuensi Alel
Data penelitian yang diperoleh dari metode PCR-SSCP, berupa pita DNA yang dibedakan berdasarkan laju migrasi dan jumlah pitanya. Frekuensi alel di fragmen exon-1, exon-2, exon-3, exon-4 dan exon-5 gen GH dianalisis dengan menggunakan rumus (Nei & Kumar 2000) :
Keterangan :
xi = frekuensi alel ke-i
nii = jumlah individu bergenotipe AiAi
nij = jumlah individu bergenotipe AiAj
n = jumlah total sampel
Frekuensi Heterozigositas Pengamatan
Analisis keragaman dilakukan melalui estimasi frekuensi heterozigositas pengamatan (Ho), heterozigositas harapan (He) dan standard error heterozigositas
harapan (Weir 1996) :
∑
Keterangan :
Ho = frekuensi heterozigositas pengamatan
N1ij = jumlah individu heterozigositas pada lokus ke-1
N = jumlah individu yang dianalisis
n
n
n
x
j i ij ii i2
2
Frekuensi Heterozigositas Harapan
∑ Keterangan :
Ho = frekuensi heterozigositas harapan
P1i = frekuensi alel ke-i pada lokus 1
n = jumlah alel pada lokus ke-1
Ragam Heterozigositas Harapan
{ (∑ ∑
) ∑
∑ }
Keterangan :
Vsl (He) = ragam heterozigositas harapan
xi = frekuensi gen ke-1
Ragam (SE) heterosigositas harapan diperoleh dari = √ (Weir 1996).
Pengujian Chi-Kuadrat
Keseimbangan Hardy-Weinberg diuji dengan Chi-Kuadrat (χ²) dengan rumus (Nei & Kumar 2000) : ∑ Keterangan : χ2 = Chi-Kuadrat O = nilai pengamatan E = nilai harapan