Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Fakultas Peternakan Universitas Mataram dan Laboratorium Pemuliaan Genetika Molekuler, Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan dari Agustus 2009 sampai dengan September 2010. Sampel darah dan catatan kelahiran DEG-Lombok diperoleh dari kecamatan Sambelia, kabupaten Lombok Timur, propinsi Nusa Tenggara Barat.
Materi Sampel Darah
Sampel darah DEG-Lombok yang digunakan berasal dari 137 ekor induk yang diambil melalui vena jugularis sebanyak 5 ml. Pengambilan sampel darah menggunakan alat-alat yaitu tabung venoject vakum, spuit, rak tabung dan larutan
ethylene diaminetetra acetic acid (EDTA) konsentrasi 0.5 M sebagai pengawet agar darah tidak membeku.
Bahan dan Alat Isolasi DNA
Isolasi DNA menggunakan beberapa bahan atau pelarut seperti Tris EDTA,
lysis buffer, digestion buffer, rinse buffer, etanol absolut, etanol 70% dan larutan pengencer DNA (Master mix).
Peralatan yang digunakan untuk isolasi DNA adalah mikro pipet dengan ukuran 20 µl, 200 µl, 1000 µl, tabung mikrotube volume 1.5 ml, Refrigerated microcentrifuge, inkubator dan vortex.
Bahan dan Alat Analisis PCR
Beberapa bahan yang digunakan untuk Polymerase chain reaction (PCR) adalah deionized water, templete DNA, primer forward dan reverse fragmen gen
BMPR-1B dan BMP-15, beberapa pereaksi PCR (Master Mix – Genaid) yang terdiri atas enzim Tag polymerase 5 unit/l, buffer 10x reaksi bebas MgCl2 25 mM dan campuran nukleotida 40 nM (masing-masing 10 mM dATP, dCTP, dGTP dan dTTP).
Peralatan yang digunakan dalam analisis PCR adalah mikropipet dengan ukuran 2.5 µl, 10 µl, 20 µl dan 200 µl, tabung mikrotube 0.15 ml dan mesin PCR (Eppendorf) serta stabilizer.
Bahan dan Alat Analisis PCR-RFLP
Bahan yang digunakan dalam analisis Polymerase chain reaction- Fragment length polymorphism (PCR-RFLP) adalah produk PCR fragmen gen
BMPR-1B, fragmen gen BMP-15, deionized water, bufer dan enzim pemotong (restriction enzym) yaitu enzim AvaII(G|GWCC) untuk gen BMPR-1B dan enzim
HinfI (G|ANTC) untuk gen BMP-15. Peralatan yang digunakan dalam analisis PCR-RFLP adalah mikropipet ukuran 2.5 µl - 10 µl, mikrotube ukuran 0.2 ml dan inkubator.
Bahan dan Alat Elektroforesis
Bahan yang digunakan untuk elektroforesis adalah agarose, loading dye, TBE 1x (1 M Tris, 0.9 M asam borat, 0.01 M EDTA pH 8.0) dan ethidium bromide (EtBr). Peralatan yang digunakan untuk elektroforesis adalah mikro pipet 10 µl, elektroforesis, power supply elektroforesis dan alat foto DNA.
Metodologi Penelitian Pengambilan Sampel darah
Sampel darah domba diambil melalui vena jugularis dengan tabung venoject
vakum sebanyak 5 ml, setelah itu sampel darah tersebut ditambahkan dengan larutan EDTA (konsentrasi 0.5 M dosis 1 µl/1 ml darah) agar darah tidak membeku dan disimpan pada freezer dengan temperatur -20oC .
Ekstraksi dan Purifikasi DNA Genom
Ekstraksi dan purifikasi DNA mengikuti metode Sambrook et al. (1989), yaitu sebanyak 500 µl sampel darah dalam tabung yang mengandung EDTA ditambahkan satu kali volume larutan I yang terdiri atas 10 mM Tris pH 7.6 ; 10 mM KCl ; 10 mM MgCl2 kemudian ditambahkan 120 l Nonidet P40 (NP40) dan dicampurkan secara merata dengan cara tabung dibolak-balikkan beberapa kali
secara perlahan-lahan. Setelah campuran merata dilanjutkan dengan sentrifugasi pada 2000 rpm selama 15 menit. Supernatan dibuang (jangan sampai pelet terbawa) dan pelet disimpan pada temperatur -200C apabila tidak segera digunakan.
Pelet yang diperoleh pada ekstraksi pertama kemudian dilarutkan dengan 800 l larutan II yang terdiri atas 10 mM Tris pH 7.6 ; 10 mM KCl ; 10 mM MgCl2 + 0.5 M NaCl ; 0.5 % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) ; 2 mM EDTA. Homogenisasi pelet dilakukan berulang kali dengan alat vorteks sehingga dapat dipastikan pelet sudah terlarutkan semua. Larutan kemudian dipindahkan ke tabung microtube ukuran 1.5 ml dan ditambahkan 400 l SS-fenol untuk denaturasi protein-protein yang masih tersisa dan dicampur dengan baik. Sentrifugasi dilakukan pada 12 000 rpm selama 10 menit dan larutan bagian atas dipindahkan ke tabung baru. Ekstraksi selanjutnya dilakukan dengan penambahan 400 l campuran larutan yang terdiri atas SS-fenol ; kloroform dan isoamilalkohol dengan perbandingan (25 : 24 : 1), masing-masing untuk memastikan degradasi protein secara sempurna dan pelarutan lemak. Pencampuran dilakukan dengan sentrifugasi pada 12 000 rpm selama 10 menit untuk pemisahan ekstrak cair dari filtratnya. Jika lapisan bagian atas masih keruh (protein belum terekstraksi sempurna), maka ekstraksi dilakukan sekali lagi dengan larutan yang sama dan disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit.
Pemurnian DNA dari RNA dilakukan dengan penambahan 20 l RNAase (10mg/ml) dan diinkubasi selama 60 menit pada temperatur 370C. Sebanyak 30 l TE (Tris EDTA) ditambahkan sehingga larutan DNA menjadi 150 l. DNA kemudian diekstraksi kembali dengan 150 l campuran SS-fenol : kloroform (1:1). Pencampuran dilakukan dengan cara tabung dibolak-balik dan disentrifugasi pada 13 000 rpm selama 20 menit untuk pemisahan ekstrak DNA (fase cair/atas) dengan filtratnya (fase bawah). Fase cair selanjutnya dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan etanol absolut (100%) untuk presipitasi DNA. Pencampuran dilakukan dengan cara tabung dibolak-balikkan berulang-ulang. DNA akan tampak seperti serat-serat putih dan dapat dipipet dengan pipet Pasteur, dipindahkan ke tabung baru, kemudian dicuci dengan pemberian 5 ml etanol 80% untuk pembersihan sisa sodium asetat. Apabila DNA sangat sedikit sehingga tidak
tampak oleh mata, maka presipitasi dapat dilakukan selama satu malam pada temperatur -200C dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada 12 000 rpm selama 10 menit untuk pengendapan DNA. Setelah dilakukan pencucian, etanol ditiriskan (jangan sampai pelet terbawa) dan dikeringkan selama 10 menit dengan pompa vakum agar sisa etanol hilang. DNA dilarutkan dalam 100 l tris/salt buffer (TE buffer), dan dibiarkan selama beberapa jam sampai satu malam sehingga DNA terlarut semua.
Amplifikasi Gen BMPR-1B dan BMP-15
Amplifikasi fragmen gen BMPR-1B dan BMP-15 menggunakan mesin PCR, dilakukan dengan proses siklus 3 langkah, yaitu (1) denaturasi, (2)
annealing/renaturasi dan (3) extension/Sintesis. Amplifikasi gen BMPR-1B dan
BMP-15 menggunakan dua set primer mengikuti Chu et al. (2007) (Tabel 5). Khusus untuk primer BMP-15 disusun berdasarkan metode penyusunan primer
Polymerase introduce restriction analyze-Polymerasi chain reaction (PIRA– PCR), metode tersebut memiliki ciri khusus yaitu (1) adanya perbedaan basa pada sekuens primer yang diperoleh, biasanya terjadi pada basa ke tiga di ujung primer, (2) situs mutasi tidak dikenali oleh enzim restriksi yang digunakan untuk mendeteksi adanya mutasi (Jacobsons dan Moskovits 1991) (Gambar 8).
Tabel 5 Sekuens primer dari gen BMPR-1B dan BMP-15
Nama
Lokus Sekuens Primer
BMPR-1B Forward: 5’-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3’
Reverse : 5’-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3’ BMP-15 Forward: 5’-CACTGTCTTCTTGTTACTGTATTTCAATGAGAC-3’
Reverse : 5’-GATGCAATACTGCCTGCTTG-3’
Sumber : Chu et al. (2007).
Fragmen gen BMPR-1B dan BMP-15 memiliki panjang produk PCR masing-masing 140 bp dan 141 bp (Gambar 6 dan 7 )
1 gtcgctatgg ggaagtttgg atgggaaagt ggcgtggcga aaaggtagct gtgaaagtgt 61 tcttcactac agaggaggcc agctggttcc gagagacaga aatatatcgg accgtgttga 121 tgaggcatga aaacatcttg ca
Keterangan: huruf yang diarsir sebagai situs pemotongan enzim AvaII (G|GWCC).
Gambar 7 Sekuens gen BMPR-1B partial pada kromosom 6 (Gen Bank dengan kode akses: GQ863577).
6121 tggcacttca tcattggaca ctgtcttctt gttactgtat ttcaatgaca ctcagagtgt 6181 tcagaagacc aaacctctcc ctaaaggcct gaaagagttt acagaaaaag acccttctct 6241 tctcttgagg agggctcgtc aagcaggcag tattgcatct gaagttcctg gcccctccag Keterangan: huruf yang diarsir sebagai situs pemotongan enzim HinfI (G|ANTC)
Gambar 8 Sekuens gen BMP-15 pada kromosom X (Gen Bank dengan kode akses: EU743938).
Pereaksi yang digunakan untuk amplifikasi ruas gen BMPR-1B dan BMP-15
adalah 1 l sampel DNA, masing-masing primer 1, 25 l, campuran dNTP 1,5l, buffer + MgCl2 2,0 l, Taq Polymerase 0,15 l dan destilated water (dH2O) dalam larutan total 15 l. Mesin PCR kemudian dijalankan dengan kondisi temperatur yaitu: (1) gen BMPR-1B, siklus pertama adalah pemisahan/denaturasi untai DNA awal pada 940C selama 5 menit, diikuti dengan 35 siklus yang masing-masing terdiri atas denaturasi (940C selama 30 detik), penempelan/annealing primer (600C selama 30 detik), perpanjangan/extension (720C selama 30 detik) dan diakhiri satu siklus berikutnya yaitu perpanjangan akhir (final extension) pada 720C selama 5 menit; (2) gen BMP-15, siklus pertama adalah denaturasi awal pada 950C selama 5 menit, diikuti dengan 30 siklus yang masing-masing terdiri atas denaturasi (950C selama 45 detik), penempelan (annealing) primer (630C selama 45 detik), perpanjangan (extension) (720C selama 60 detik) dan diakhiri satu siklus berikutnya yaitu perpanjangan akhir (final extension) pada 720C selama 10 menit (Chu et al. 2007). Setelah siklus terakhir selesai, mesin PCR dimatikan kemudian tabung diambil dan disimpan pada temperatur 40C untuk dianalisa lebih lanjut.
Analisis PCR-RFLP
Produk PCR yang diperoleh dari hasil amplifikasi fragmen gen BMPR-1B
dan BMP-15 dipotong masing-masing dengan enzim pemotong AvaII(G|GWCC) dan HinfI (G|ANTC). Volume dan bahan pereaksi yang digunakan untuk setiap enzim pemotong adalah 2.0 l deionized water, 0.5 l enzim pemotong, buffer
1,5 l dan produk PCR 5l. Campuran sampel produk PCR fragmen gen BMPR- 1B dan BMP-15 serta bahan pereaksi diinkubasi di dalam inkubator pada temperatur 37oC selama lebih kurang 16 jam.
Elektroforesis
Elektroforesis DNA total, produk PCR, dan produk pemotongan (PCR- RFLP) dilakukan pada media gel agarose dengan konsentrasi yang berbeda. Konsentrasi agarose 1% digunakan untuk elektroforesis DNA total (0.3 g/30 ml TBE 0.5 x), produk PCR 1.5% (0.75 g/30 ml TBE 0.5 x) dan produk pemotongan 3% (0.9 g/30 ml TBE 0.5 x). Gel agarose dibuat sesuai dengan konsentrasi yang dibutuhkan, kemudian dipanaskan di microwave sampai mendidih (larutan terlihat bening), kemudian ditambahkan EtBr sebanyak 3 l (10 mg/ml) dan dibiarkan sebentar agar dingin. Sebelum membeku gel agarose dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan, kemudian sisir untuk sampel diletakkan di dalam gel agarose dan dibiarkan sampai membeku (Sulandari dan Zein 2003).
Sebelum piranti elektroforesis dijalankan, sampel dimasukkan ke setiap sumur sampel, larutan atau buffer TBE 0.5 x (1 M Tris: 0.9 M asam borat: 0.01 M EDTA pH 8.0) volumenya sudah cukup dan sampel siap dijalankan. Alat elektroforesis yang digunakan adalah Mupid Elektrophoresis yang dimigrasikan dari kutub negatif (katoda) kepositif (anoda) dengan arus 100 volt selama 45 menit. Hasil elektroforesis diamati dengan bantuan alat foto DNA. Terlihatnya pita (band) pada gel agarose menunjukkan keberhasilan dari isolasi DNA total, amplifikasi PCR atau ada tidaknya variasi (keragaman) fragmen gen BMPR-1B
dan BMP-15. Penentuan posisi pita DNA pada gel agarose dilakukan secara manual berdasarkan asumsi bahwa semakin kecil ukuran molekul nukleotida maka laju migrasi didalam gel agarose semakin cepat menuju elektrode positif (Muladno 2002).
Penghitungan Litter Size
Penghitungan litter size dilakukan berdasarkan tipe kelahiran dan jumlah kelahiran anak domba pada setiap kali melahirkan. Informasi catatan kelahiran diperoleh dengan cara melakukan pencatatan kelahiran anak selama penelitian dilakukan dan informasi catatan kelahiran sebelum penelitian diperoleh melalui tanya jawab dengan pemilik ternak DEG-Lombok.
Analisis Data Frekuensi Alel
Frekuensi alel gen BMPR-1B dan BMP-15 dihitung dengan rumus (Nei dan Kumar 2000):
mnKeterkkkkkkkkkkkmm
Keterangan:
Xi = frekuensi alel ke-i
nii = jumlah individu bergenotipe AiAi nij = jumlah individu bergenotipe AiAj n = jumlah total sampel
Keseimbangan Hardy Weinberg
Keseimbangan Hardy Weinberg diuji dengan uji χ2 (Hartl dan Clark 1997):
Keterangan: χ2
= uji Chi- Kuadrat
Obs = jumlah pengamatan genotip ke-i Exp = jumlah harapan genotip ke-i
Nilai Heterozigositas
Keragaman genetik (genetic variability) dilakukan melalui estimasi frekuensi heterozigositas pengamatan (Ho), heterozigositas harapan (He) dan standar eror heterozigositas harapan (Weirs 1997):
Nilai heterozigositas pengamatan dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Keterangan:
Ho=frekuensi heterozigositas pengamatan
N1ij= jumlah individu heterozigositas pada lokus ke-1
Nilai heterozigositas harapan dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Keterangan:
He = heterozigasitas harapan
P1i = frekuensi alel ke I pada lokus 1 n = jumlah alel pada lokus ke-1
Nilai Standar eror heterozigositas harapan dihitung dengan menentukan ragam heterozigositas harapan:
Keterangan:
(He) = ragam heterozigositas harapan Xi = frekuensi gen ke -i
Standar eror (SE) heterozigositas harapan diperoleh dari
Nilai
Polymorphic Informative Content (PIC)Tingkat informasi suatu alel dihitung dengan pendekatan nilai Polymorphic informative content (PIC):
Keterangan Pi= frekuensi alelke i
n = jumlah alel per perinci (marker)
Perbedaan Rataan Litter size
Nilai rataan litter size dari setiap induk DEG-Lombok diperoleh dengan cara membagi nilai akumulasi jumlah anak dengan jumlah periode melahirkan. Perhitungan rataan litter size dilakukan terhadap induk yang telah melahirkan anak minimal sebanyak tiga kali periode kelahiran. Perbedaan rataan litter size
antara genotipe fragmen gen BMPR-1B dan BMP-15 dianalisis dengan uji t (Mendenhall 1987) ; ) ( 0 2 1 2 1
)
(
x x hs
x
x
t
Keterangan:
1
x dan x2 = rataan litter size genotipe 1 dan 2 n1 dan n2 = jumlah individu genotipe 1 dan 2
22 2 1 2 2 2 1 2 1
;
2 1
n
s
n
s
s
s
x x g
1
1 2 2
n
x
x
s
n i iHASIL DAN PEMBAHASAN