3. Analisis Kimia Tepung Kecambah Kacang Komak
f. Analisis Kadar Air Metode Oven Biasa (AOAC, 1995)
Cawan aluminium dikeringkan dalam oven pada suhu 100 oC selama 15 menit, lalu didinginkan dalam desikator selama 10 menit. Ditimbang cawan dengan neraca analitik (a gram). Ditimbang sampel dengan neraca analitik sebanyak 4-5 gram (b gram). Dikeringkan dalam oven pada suhu 100 -105oC selama kurang lebih 6 jam, didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang (c gram). Dikeringkan kembali dalam oven selama 15-30 menit, lalu ditimbang kembali. Pengeringan diulangi hingga diperoleh berat sampel yang relatif konstan (berat dianggap konstan jika selisih berat sampel kering yang ditimbang ≤0.0003 gram).
Kadar air (%basis kering) = b – (c-a) x 100 % c-a
Keterangan :
a = bobot cawan kosong (g) b = bobot sampel (g)
c = bobot sampel+cawan sesudah dikeringkan (g) g. Kadar Abu (Apriyantono et al., 1989)
Pengukuran kadar abu ditentukan dengan alat tanur. Cawan porselin dipanaskan dahulu dalam oven, kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Sampel ditimbang 2.0 - 3.0 gram, lalu dimasukkan ke dalam cawan porselen dan dipanaskan dalam oven selama 30 menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam tanur pada suhu 600 °C selama 4-5 jam. Sampel lalu dimasukkan ke dalam desikator dan ditimbang. Pengabuan diulangi hingga diperoleh berat sampel yang relatif konstan (selisih berat sampel kering yang ditimbang ≤0.0003 gram).
% kadar abu = berat abu x 100 % berat sampel
Sampel sebanyak 0.1 gram dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 100 ml, lalu ditambahkan 2.0 gram K2SO4, 40 mg HgO dan 2.5 ml H2SO4 pekat. Setelah itu didestruksi sampai cairan berwarna jernih dan dibiarkan sampai dingin. Isi tabung dipindahkan ke alat destilasi dan labu dibilas 5–6 kali dengan 1-2 ml air. Kemudian ditambahkan 8-10 ml NaOH-Na2S2O3 pekat sampai warna coklat kehitaman, lalu didestilasi. Hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer yang berisi 5 ml H3BO3 dan 2 tetes indikator (campuran 2 bagian merah metil 0.2 % dalam alkohol dan 1 bagian metilen blue 0.2 % dalam alkohol), lalu dititrasi dengan HCl 0.02 N yang telah distandarisasi hingga berubah warna dari hijau menjadi abu-abu.
% N = (ml sampel - ml blanko) x N HCl x 14.007x 100 % berat sampel basis kering (mg)
Kadar Protein = %N x faktor konversi i. Kadar Lemak (AOAC, 1984)
Labu lemak yang akan digunakan dalam alat ekstraksi soxhlet dikeringkan di dalam oven, lalu didinginkan di dalam desikator kemudian ditimbang. Ditimbang 2 g sampel di dalam gelas piala, ditambahkan 30 ml HCl 25% dan 20 ml air serta beberapa batu didih. Ditutup gelas piala yang dengan gelas arloji dan dididihkan selama 15 menit (larutan sampel). Disaring larutan sampel dengan kertas saring dalam keadaan panas dan didicuci dengan air panas hingga tidak bereaksi asam lagi.
Kertas saring yang digunakan untuk menyaring larutan sampel dikeringkan berikut isinya pada suhu 100-105oC (kertas saring sampel). Dimasukan kertas saring sampel ke dalam kertas pembungkus sampel yang telah dilengkapi kapas dibagian ujungnya kemudian dibentuk menjadi bentuk tabung (timbel). Timbel tersebut diekstrak dengan heksana selama 2-3 jam pada suhu kurang lebih 80oC. Selanjutnya, labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi dipanaskan di dalam oven pada suhu 100-105°C. Setelah itu didinginkan di dalam desikator, kemudian ditimbang.
% lemak = (berat lemak+labu) – bobot labu x 100 % berat sampel
Kadar karbohidrat (%) = 100 % - % ( kadar protein + lemak + air + abu)
2. Analisis Serum Darah dan Organ Tikus
a. Analisis Kolesterol Total (Metode CHOD-PAP)
Prinsip pengukuran kolesterol total adalah hidrolisis enzimatis dan oksidasi. Serum yang mengandung lipoprotein direaksikan reagen kolesterol (Tabel 10). Kolesterol ester pada lipoprotein dipecah oleh enzim kolesterol esterase menjadi kolesterol dan asam lemak. Kolesterol kemudian mengalami oksidasi dengan enzim kolesterol oksidase sebagai katalis menghasilkan senyawa peroksida yang direaksikan bersama fenol dan 4-aminoantripyrine menghasilkan senyawa quinone imine yang berwarna merah (Gambar 8) dan dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 500 nm (Gambar 9).
Kolesterol ester + H2O Kolesterol + asam lemak
Kolesterol + O2 4-kolesten-3-one + H202
2 H2O2 + fenol + 4-aminoantripyrine quinoneimine + 4H20
Perhitungan :
10 µl serum atau standar + 1.00 ml reagen kolesterol
Di vorteks
Diinkubasi pada suhu 370C, 5 menit
Dibaca absorbansi pada λ 500 nm
Gambar 9. Prosedur Analisis Sampel atau Standar Kolesterol Total
Kolesterol oksidase
peroksidase
Gambar 8. Reaksi-reaksi yang Terlibat dalam Analisis Kolesterol Total
Kadar kolesterol (mg/dl) = ( A sampel / A standar) x 200 mg/dl Keterangan :
A = absorbansi
200 = Standar kolesterol murni 200 mg/dl (5.2 mmol/l) Tabel 10. Komposisi Reagen Kolesterol
Komponen penyusun Jumlah
Good’s buffer pH 6.7 50 mmol/l
Phenol 5 mmol/l
4-aminoantipyrine 0.3 mmol/l
Cholesterol esterase (CHE) ≥ 200 U/I
Cholesterol oxidase (CHO) ≥ 50 U/I
Peroxidase (POD) ≥ 3 kU/I
b. Analisis High Density Lipoprotein (Metode CHOD-PAP)
Prinsip penentuan kadar HDL adalah mengendapkan kilomikron, VLDL, dan LDL dengan menambahkan asam fosfotungstat dan ion magnesium. Proses sentrifugasi akan meninggalkan hanya HDL dalam supernatan. Kadar HDL kemudian ditentukan secara enzimatis menggunakan reagen kolesterol (Tabel 11). Persiapan sampel serum sebelum analisis dapat dilihat pada Gambar 10 dan analisis kadar HDL sampel dapat dilihat pada Gambar 11.
200 µl serum + 500 µl reagen presipitasi
Di vorteks
Diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit
Sentrifuse 4000 rpm, 10 menit
Perhitungan :
Kadar HDL (mg/dl) = ( A sampel / A standar) x 200 mg/dl
Keterangan : A = absorbansi
200 = Standar kolesterol murni 200 mg/dl (5.2 mmol/l)
Tabel 11. Komposisi Reagen Presipitasi
Komponen penyusun Jumlah
Asam fosfotungstat 1.4 mmol/l
Magnesium klorida 8.6 mmol/l
c. Analisis Trigliserida (Metode GPO-PAP)
Prinsip pengukuran kadar trigliserida adalah hidrolisis enzimatis dan oksidasi. Sampel serum direaksikan dengan reagen trigliserida (Tabel 12). Trigliserida akan dihidrolisis oleh enzim lipase menghasilkan gliserol dan asam lemak. Gliserol kemudian diubah menjadi gliserol-3-fosfat oleh enzim gliserolkinase. Gliserol-3-fosfat yang dihasilkan dioksidasi menghasilkan dihidroksi aseton fosfat dan peroksida. Peroksida yang dihasilkan akan bereaksi lebih lanjut dengan aminofenazon dan 4-klorofenol menghasilkan senyawa quinone imine (Gambar 12) yang
Gambar 10. Prosedur Persiapan Sampel Analisis Kadar HDL 100 µl standar + 1 ml reagen kolesterol
Di vorteks
Diinkubasi pada suhu 370C, 5 menit
Dibaca absorbansi pada λ 500 nm
berwarna merah dan dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 500 nm (Gambar 13).
Trigliserida + H2O gliserol + asam lemak
Gliserol + ATP gliserol-3-fosfat + ADP
Gliserol-3-fosfat + O2 dihidroksi aseton fosfat + H2O2
2H2O2 + 4-aminofenazon + 4-klorofenol quinone imine + HCl + 4 H2O
Perhitungan :
Kadar Trigliserida (mg/dl) = ( A sampel / A standar) x 200 mg/dl
Keterangan : A = absorbansi
200 = Standar trigliserida murni 200 mg/dl (2.3 mmol/l) peroksidase lipase
gliserolkinase
Gliserol 3-fosfatoksidase
10 µl serum atau standar + 1.00 ml reagen trigliserida
Di vorteks
Diinkubasi pada suhu 370C, 5 menit
Dibaca absorbansi pada λ 500 nm
Gambar 13. Prosedur Analisis Kadar Trigliserida Sampel atau Standar
Tabel 12. Komposisi Reagen Trigliserida
Komponen penyusun Jumlah
Good’s buffer pH 7.2 50 mmol/l
4-Clorophenol 4 mmol/l
ATP 2 mmol/l
Mg 2+ 15 mmol/l
Glycerokinase (GK) ≥ 0.4 kU/I
Peroxidase (POD) ≥ 2 kU/I
Lipoprotein lipase (LPL) ≥ 2 kU/I
4-aminoantipyrine 0.5 mmol/l
Glycerol-3-phosphate-oxidase (GPO) ≥ 0.5 kU/I
d. Analisis Low Density Lipoprotein (Friedwald et al., 1972)
Kadar LDL dihitung secara matematis dengan menggunakan rumus :
Keterangan : Asumsi TG/5 adalah kadar VLDL.
e. Indeks Atherogenik (Balsinska, 1998)
Indeks atherogenik (IA) dapat dihitung dengan menggunakan rumus :
f. Analisis Malonaldehida (Conti et al., 1991)
Analisis malonaldehida dilakukan pada sampel organ hati dan limpa tikus. Prinsip analisis malonaldehida ini adalah pemanasan akan menghidrolisis peroksida lipid sehingga malonaldehida yang terikat akan bebas dan bereaksi dengan TBA dalam suasana asam memberntuk kompleks MDA-TBA yang berwarna merah yang dapat diukur pada panjang gelombang 532 nm. Prosedur analisis malonaldehida organ hati dan limpa pada Gambar 14.
Kadar LDL = Total kolesterol –( HDL+ TG/5)
Sebagai standar MDA digunakan 1,1,3,3 tetraetoksipropana (TEP). Pada suasana asam, TEP terhidrolisis dan menghasilkan hemiasetal dan etanol. Hemiasetal yang terbentuk kemudian terdekomposisi menjadi etanol dan malonaldehid. Penentuan kurva standar dilakukan sama dengan penentuan sampel. Perhitungan kadar MDA sampel berdasarkan hasil ploting nilai absorbansi pada kurva standar (Lampiran 4). Konsentrasi TEP yang digunakan yaitu 0,0; 1,2; 2,4; 3,6; 4,8; 6,0; 7,2; 15,0; dan 24,0 x10-3 pmol/ml.
Ditambah 2 ml larutan TCA 15 % dan TBA 0.37% dalam HCl 0.25 N
Di vorteks dan dipanaskan dalam penangas air pada suhu 800C selama 15 menit
Didinginkan sampai suhu ruang
Gambar 14. Prosedur Analisis Kadar MDA Organ Hati dan Limpa Disentrifuse 3000 rpm selama 15 menit
Diukur absorbansi pada λ 532 nm
Ditimbang organ hati sebanyak 1 gram atau limpa
Ditambah larutan PBS dingin sebanyak 9 ml
Dihancurkan dengan cara di gerus
Disentrifuse pada 3000 rpm selama 15 menit
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN