Analisis yang dilakukan pada penelitian kali ini meliputi uji organoleptik dan analisis kimia. Uji organoleptik dilakukan dengan metode rating hedonik pada keseluruhan atribut mutu (Soekarto, 1985). Analisis kimia yang dilakukan adalah pengujian kadar zat besi, kalsium, dan seng metode Absorpsi Atom Spektrofotometri (AAS) (Apriyantono et al., 1989 dan AOAC, 1995), kadar vitamin A metode HPLC (AOAC, 2001 dan AOAC, 2005), kadar vitamin C metode titrasi iodometri (Jacobs, 1984).
1. Analisis Kadar Logam (Zat Besi, Kalsium, dan Seng) Metode Absorpsi Atom Spektrofotometri (AAS) (Apriyantono et al., 1989 dan AOAC,1995)
Penetapan kadar logam total dalam penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode Absorpsi Atom Spektrofotometri (AAS). Prinsip dari metode ini adalah residu sampel yang telah dihilangkan kandungan bahan-bahan organiknya dengan menggunakan pengabuan kombinasi dapat dilarutkan dalam asam encer H2SO4 pekat. Larutan disebarkan dalam nyala api yang ada di dalam AAS sehingga absorpsi atau emisi logam dapat dianalisis dan diukur pada panjang gelombang tertentu.
a. Kalibrasi Alat dan Penetapan Sampel
Alat AAS diatur sesuai dengan instruksi dalam manual alat tersebut. Diencerkan larutan stok standar (1000 mg/L) kalsium, seng, dan zat besi dengan menggunakan air demineralisasi sampai konsentrasinya berada dalam kisaran kerja logam yang bersangkutan seperti dapat dilihat pada Tabel 8. Larutan standar logam dan blanko diukur nilai absorpsinya. Larutan sampel diukur nilai absorpsinya (selama penetapan
30 sampel, diperiksa secara periodik apakah nilai standar tetap konsisten). Pembuatan kurva standar untuk masing-masing logam (nilai absorpsi vs konsentrasi dalam mg/L).
Tabel 8. Kondisi yang direkomendasikan untuk analisis logam
Unsur
Panjang Gelombang
(A")1
Limit deteksi (µg logam
ml)1
Kisaran Kerja (µg logam/
ml)1
Sistem Nyala2
Kalsium 422.7 0.01 0.05 – 5 Udara
Asetilen N2O5
Seng 213.9 0.004 0.1 – 2
Zat Besi 248.3 0.03 0/05 – 5
1Apriyantono et al. (1989)
2AOAC (1995)
b. Perhitungan
Konsentrasi logam total dalam sampel dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
Kadar Logam (mg/L) = (a x 100 x FP)/ W Keterangan :
a = konsentrasi larutan sampel yang terbaca dari kurva standar (mg/L) FP = Faktor pengenceran
W = berat sampel (g)
2. Analisis Kadar Vitamin A Metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography) (AOAC, 2001 dan AOAC 2005)
a. Prinsip Kerja
Standar dan contoh disabunkan dalam larutan etanol – air basa, dinetralkan dan dilarutkan, sehingga mengubah lemak menjadi asam lemak dan ester retinol. Retinol dianalisis menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (High Performance Liquid Chromatography) dengan detector UV pada panjang gelombang 328 nm.
b. Prosedur
1. Penyiapan Larutan Standar
Larutan stok standar vitamin A 250 iu/ml
Sebanyak 25 mg Standar vitamin A asetat SIGMA (1 gram vitamin A asetat setara dengan 2,800,000 IU vitamin A) ditimbang dengan teliti ke dalam labu takar amber 100 ml, ditambahkan 10 ml aquabides, ditambahkan 3 ml aseton untuk membantu pelarutan, kemudian dilarutkan hingga tanda tera menggunakan etanol 95%. Larutan stok standar ini harus selalu baru.
31 Larutan deret standar vitamin A
Sebanyak 0.25 ml – 0.50 ml – 1.0 ml larutan stok standar vitamin A masing-masing dipipet ke dalam erlenmeyer 100 ml bertutup asah. Lalu masing-masing larutan standar ini ditambahkan 10 ml ethanol 95% dan 2.5 ml KOH 50% (dilarutkan 500 gram KOH dengan aquabides hingga 1 liter).
Selanjutnya masing-masing larutan standar direfluks di atas penangas air suhu 80oC selama 40 menit, didinginkan, dan ditambahkan 2.5 ml asam asetat glasial.
Kemudian, masing-masing larutan standar digoyangkan hingga larut, dibiarkan dingin, dimasukkan ke dalam labu takar amber 25 ml, ditera dengan larutan THF dan etanol dengan perbandingan 1:1, lalu dihomogenkan dengan membulak-balikkan labu takar. Larutan deret standar ini stabil selama dua minggu dan bisa diencerkan sesuai kebutuhan konsentrasi dalam contoh yang pengerjaannya dilakukan sama seperti yang sudah diuraikan.
2. Penyiapan Larutan Contoh
Contoh uji padatan dihaluskan hingga mencapai ukuran 40 mesh. Lalu, sebanyak 5 gram contoh uji ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer 100 ml, ditambahkan 10 ml aquabides, dan ditambahkan 4 ml etanol 95%.
Erlenmeyer lalu digoyangkan untuk memastikan semua bahan tercampur dengan penambahan batu didih untuk mempercepat pemanasan.
3. Ekstraksi dan Penyabunan
Penangas air dan pendingin kondensor dinyalakan, dipipet 10 ml KOH 50% ke dalam erlenmeyer contoh, diletakkan dengan cepat di atas penangas air suhu 80oC dengan pendingin kondensor diletakkan di atas bibir erlenmeyer. Larutan ini direfluks selama 40 menit dengan digoyangkan tiap 10 menit. Setelah 40 menit, erlenmeyer diangkat dari penangas, didinginkan hingga suhu ruang, ditambahkan asam asetat glasial 10 ml untuk menetralkan KOH, diaduk rata, dan dibiarkan dingin hingga suhu ruang. Larutan ini lalu dipindahkan dengan teliti kedalam labu takar amber 100 ml dan ditera dengan larutan Campuran THF : etanol (1:1), labu takar dibolak-balikkan, disimpan semalam atau labu disimpan selama satu jam di dalam lemari pendingin untuk mengendapkan asam lemak yang terbentuk selama proses penyabunan. Dalam kasus tertentu sentrifugasi dapat digunakan untuk mempercepat pengendapan.
4. Penetapan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dinyalakan, dibiarkan stabil selama 30 menit dengan pengaliran fase gerak pada kecepatan 1 ml/ menit. Larutan standar vitamin A yang telah melalui proses penyabunan diinjeksikan, lalu diatur fase gerak untuk mendapatkan resolusi bentuk cis dan trans. Semua trans retinol larut dan cis retinol akan larut sebagai sebuah peak kecil sebelum bentuk trans.
Deret standar dan contoh diinjeksikan ke dalam botol-botol kecil autosampler lalu diletakkan di dalam KCKT. Standar yang diuji harus masuk kedalam range peak contoh dengan cara standar atau contoh diencerkan.
32 Kondisi KCKT atau HPLC yang dipergunakan adalah :
Jenis KCKT /HPLC : Agilent Series Kolom : C 18 (5µm) Detektor : UV Panjang gelombang : 328 nm Flow rate : 1 ml/menit
Mobile phase : Air aquabidest : Metanol (5:95) Volume injek : 20 µl autosampler
c. Perhitungan
Konsentrasi Vitamin A (IU/g) Csp = Asp – a x VAsp x Vi st b W sp Vi sp Keterangan :
Csp = konsentrasi contoh (iu/gram) a = intercept
b = slope
Vasp = Volume Akhir contoh ( ml ) Wsp = Bobot contoh ( gram ) Vi st = Volume injek standar ( ul ) Vi sp = Volume injek contoh ( µl )
5. Analisis Kadar Vitamin C Metode Titrasi Iodometri (Jacobs, 1984) a. Standarisasi Iodin
Standarisasi Iodin diawali dengan pemipetan 10 ml larutan iodin ke dalam erlenmeyer 250 ml, ditambahkan 150 ml aquades, ditambahkan HCL 2N sebanyak 5 ml, lalu ditambahkan indikator amilum tiga tetes. Larutan ini segera dititrasi menggunakan larutan Na2S2O3 yang telah distandarisasi. Titik akhir ditandai dengan perubahan warna larutan menjadi tak berwarna.
b. Standarisasi Na2S2O3
Standarisasi Na2S2O3 diawali dengan penimbangan 0.05 gram K2Cr2O7, dilarutkan ke dalam aquades 25 ml dalam erlenmeyer 250 ml, ditambahkan 5 ml HCL 25%, lalu ditambahkan KI 20% 10 ml. Larutan segera dititrasi dengan Na2S2O3. Ketika larutan mulai berubah warna menjadi kuning muda, ditambahkan indikator amilum tiga tetes lalu dititrasi lagi hingga warna biru menghilang.
c. Penetapan Kadar Vitamin C
Penetapan kadar vitamin C diawali dengan penimbangan 10 gram sampel dilarutkan ke dalam 100 ml aquades. Larutan ini lalu ditambahkan 12.5 ml asam trikloroasetat (TCA) 8%, distirer selama 5 menit, lalu disentrifuse pada 1,400 rpm selama 5 menit. Penambahan asam trikloroasetat bertujuan meminimalisasi atau menghambat interfensi dari ion besi (Fe). Supernatan hasil sentrifuse disaring
33 dengan kertas saring kasar dan dipindahkan ke dalam erlenmeyer. Sebelum dititrasi, larutan ditambahkan indikator amilum tiga tetes. Larutan segera dititrasi dengan larutan iodin 0.01 N hingga muncul warna biru pertama kali yang menandakan titik akhir titrasi.
d. Perhitungan
Konsentrasi Vitamin C (%)
Csp = (Vsampel – Vblanko) x N I2 x 88.06 x FP x 100%
Wsampel x 1000 Keterangan :
Csp = konsentrasi contoh (%)
Vsampel = Volume sampel yang tertitrasi (ml) Vblanko = Volume blanko yang tertitrasi (ml) NI2 = Konsentrasi I2 hasil standarisasi (mol/L) FP = Faktor Pengenceran
W sampel = Bobot sampel (gram)
6. Uji Organoleptik (Meilgaard et al., 1999)
Uji organoleptik menggunakan metode hedonic rating test dilakukan untuk melihat tingkat kesukaan. Atribut-atribut yang diamati meliputi aroma, rasa, tekstur, mouthfeel, dan aftertaste. Uji ini dilakukan dengan menggunakan skoring dengan 5 skala kesukaan, yaitu 1 = sangat tidak suka; 2 = tidak suka; 3 = netral/antara suka dan tidak suka; 4 = suka; dan 5 = sangat suka. Standar skoring perusahaan adalah 3.5. Panelis yang digunakan adalah 24 orang panelis semi terlatih. Pada uji rating hedonik, panelis diminta memberikan skor untuk setiap atribut yang diujikan pada sampel sesuai tingkat kesukaannya. Pengolahan data uji hedonik pada tahap penelitian pendukung menggunakan bantuan program statistik, yaitu SPSS 13.0.