Hewan coba yang digunakan dalam penelitian adalah 4 ekor ayam petelur ras ISA Brown berumur 10 minggu untuk menghasilkan Imunoglobulin Y Antilipase dan 1 ekor ayam petelur ras ISA Brown berumur 10 minggu sebagai kontrol, serta 12 ekor kelinci jantan ras New Zealand White berumur 6 bulan. Enzim lipase pankreas yang digunakan adalah enzim lipase pankreas babi (Appli Chem #A9520). Bahan-bahan yang digunakan untuk metode Bradford adalah: Larutan dye commasie brilliant blue (Bio-Rad #500-0006) dan protein Bovine Gamma Globulin. Bahan-bahan yang digunakan untuk SDS-PAGE adalah: Acrylamide 40% (Bio-Rad #161-0154), Ammonium Ferrosulfat (AFS), buffer Tris HCl, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Acrilamide, Tetra Mehyl Etilen Diamin
(TEMED), air deionisasi, bromphenol blue, -mercaptoethanol, dan pewarna
commasie blue. Bahan-bahan yang digunakan untuk ELISA adalah: non dried fat milk, konjugat rabbit anti-chickhen IgY (IgG)yang dilabel Horseradish Peroxidase (HRP)(Sigma #A9046), dan substrat ABTS (2 ,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid). Bahan-bahan yang digunakan untuk purifikasi IgY adalah: kuning telur, TBS-Tween, dekstran sulfat, CaCl2, sodium sulfat, TBS, dan PBS. Bahan-bahan yang digunakan untuk Immunoblotting
adalah: Tris, glisin, metanol, kertas transfer (pure nitrocellulose membrane 0.45 µm), non fat milk, PBS, TBS-T, konjugat rabbit anti-chickhen IgY (IgG)yang dilabel peroxidase (Sigma #A9046), Pewarna Ponceaus, dan Pewarna
Diaminobenzidine. Bahan-bahan yang digunakan untuk uji in vitro adalah: orlistat (Xenical®), IgY antilipase, IgY kontrol, substrat DTNB (((5,5’-dithiobis(2-nitro benzoic acid) dan DMPTB (2,3-dimercapto-1-propanol tributyrate). Bahan-bahan untuk uji in vivo adalah orlistat (Xenical®), PBS, kuning telur, kuning telur yang mengandung IgY antilipase, dan pakan standar (Indo Feed® K-03 Super).
Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Mini-PROTEAN® 3 Cell (Bio Rad #165-3301), ELISA reader (Multiskan EX, Thermo), spektrofotometer (Ultrospec® 1100 pro), magnetic stirer, ELISA plate, high speed refrigerated micro centrifuge (Tomy MX-307), safety cabinet,inkubator, mikropipet, oven, dan soxhlet.
Preparasi Enzim Lipase
Enzim lipase pankreas babi dilarutkan dalam PBS (Phosphate Buffer Saline) steril 1 M pH 7,4 dengan konsentrasi 2,5 mg/mL. Akan tetapi, enzim lipase pankreas babi tersebut tidak sepenuhnya larut dalam PBS atau air. Hal ini menimbulkan pertanyaan, apakah lipase berada pada bagian terlarut atau tidak terlarut. Untuk memastikan hal tersebut, dilakukan SDS-PAGE pada larutan lipase, fraksi terlarut, dan fraksi tidak terlarut untuk melihat profil protein pada masing-masing fraksi. Fraksi terlarut merupakan supernatan yang didapat setelah larutan lipase disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 x g selama 10 menit,
sedangkan fraksi tidak terlarut merupakan platelet yang didapat setelah larutan lipase disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 x g selama 10 menit sebanyak dua kali. Larutan lipase, fraksi terlarut, dan fraksi tidak terlarut kemudian diukur masing-masing konsentrasi proteinnya menggunakan metode Bradford.
Metode Bradford
Metode ini berdasarkan pengikatan protein pada larutan dye comassie brilliant blue. Larutan dye comassie brilliant blue setelah berikatan dengan protein akan diabsorbsi secara maksimum pada panjang gelombang 595 nm (Wilson dan Walker 2000). Sebagai standar, digunakan protein Bovine Gamma Globulin (Bovine IgG)dengan berbagai konsentrasi. Sebanyak 200 µL larutan Bradford (dye comassie brilliant blue, etanol 95%, asam orto fosfat 85%, dan akuades) ditambahkan pada 800 µL sampel (protein standar atau lipase), kemudian diinkubasikan selama 10 menit, lalu dilakukan pembacaan pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 595 nm.
Kurva standar dibuat dari pengenceran Bovine IgG, kemudian dibuat persamaan regresinya, yaitu: Y = ax + b, Y adalah besarnya absorbsi, a adalah koefisien regresi, x adalah konsentrasi sampel dan b adalah suatu konstanta. Konsentrasi protein dihitung dari persamaan regresi kurva standar.
Analisis Kemurnian Enzim Lipase dengan SDS-PAGE
SDS PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) dilakukan pada larutan lipase, fraksi terlarut, dan fraksi tidak terlarut. Prosedur elektroforesis sebagai berikut.
Gel pemisah (separating gel) terdiri atas: 50 µL APS (Ammonium Persulfat), buffer Tris HCl 1.5 M pH 8.8, 100 µL SDS, Acrilamide 40%, 5 µL TEMED, dan air deionisasi sampai volume 4.9 mL. Setelah gel pemisah mengeras, disiapkan gel pengumpul (stacking gel) yang terdiri atas: 25 µL APS (Ammonium Persulfat), 1.25 mL buffer Tris HCl 1.5 M pH 6.8, 5 µL SDS, 375 µL Acrilamide 40%, 5 µL TEMED, dan air deionisasi sampai volume 3.25 mL. Gel pengumpul dicetak dengan bantuan “sisir” (comb) untuk membuat sumur tempat memasukkan sampel. Setelah gel mengeras, sisir diangkat.
Sampel dilarutkan dalam campuran buffer sampel (SDS Reducing Buffer) dan -mercaptoethanol (perbandingan 5:1). Sampel lalu dipanaskan pada suhu 95oC selama 5 menit. Sebanyak 20 µL sampel dimasukkan ke dalam sumur gel. Proses pemisahan protein menggunakan buffer pemisah (running buffer) yang terdiri atas: Tris HCl 0,025 M, glisin 0,192 M, dan SDS 0,1% pH 8.8. Pemisahan dilakukan pada kekuatan arus 400 mA dengan voltase 90 V untuk setiap gel. Setelah elektroforesis selesai, gel diwarnai commasie blue sambil digoyang-goyang selama 20 menit. Sisa pewarnaan kemudian dihilangkan dengan
destaining solution (metanol 40%, asam asetat 10%, air deionisasi 50%) .
Kurva standar dibuat dari nilai Mobility Rate (Mfatau Rf), kemudian dibuat persamaan regresinya, yaitu: Y = ax + b, Y adalah log bobot molekul, x adalah
Mobility Rate dan b adalah suatu konstanta. Mobility Rate diukur dengan rumus: Rf = Jarak pergerakan pita protein dari tempat awal
Produksi Antibodi IgY Antilipase pada Ayam
Produksi IgY antilipase dilakukan pada 4 ekor ayam betina ras ISA Brown berumur 10 minggu,sedangkan 1 ekor ayam betina ras ISA Brown berumur 10 minggu dijadikan kontrol. Ayam-ayam tersebut dipelihara dalam kandang baterai dan diberi pakan komersial standar CP 324 dan air minum secara ad libitum. Lima ekor ayam petelur yang digunakan dipastikan terlebih dahulu tidak memiliki antibodi terhadap enzim lipase. Setelah dipastikan tidak memiliki antibodi terhadap enzim lipase, empat ekor ayam petelur diimunisasi dengan 0,5 mL larutan enzim lipase (2,5 mg/mL dalam PBS), 0,55 mL adjuvan Quil-A 2 mg/mL, dan merthiolate 0.01% secara intramuskuler pada minggu ke-12. Satu ekor dijadikan sebagai kontrol negatif. Penyuntikan kemudian diulang pada minggu ke-14 dan 18.Dua minggu setelah imunisasi, dilakukan pengambilan darah dari vena brachialis, untuk kemudian dilakukan pengukuran titer antibodi terhadap lipase pada serum.
Penghitungan Titer Antibodi terhadap Enzim Lipase dengan ELISA
Sebelum menghitung titer antibodi terhadap enzim lipase pada serum, dilakukan ELISA Checkerboard untuk menentukan konsentrasi optimum enzim lipase dan serum sehingga penghitungan titer antibodi memberikan hasil optimum. Konsentrasi optimum enzim lipase yang didapat adalah 8 µg/mL dengan pengenceran serum 1/200. Prinsip ELISA adalah ikatan antara antigen dengan antibodi yang dideteksi dengan antibodi yang dilabel. Teknik ELISA yang digunakan sesuai dengan Akita dan Nakai (1994) dengan beberapa modifikasi.
Enzim lipase 8 µg/mL dicoating pada ELISA plate, kemudian diinkubasikan pada suhu 4oC selama satu malam. Kemudian dilakukan bloking dengan susu skim (non dried fat milk) 50 mg/mL untuk menutupi bagian sumur yang tidak dicoating agar tidak berikatan dengan antibodi. Serum dengan pengenceran 1/200 dimasukkan ke lajur pertama, kemudian diencerkan secara serial. Kemudian diinkubasikan selama 2 jam pada suhu ruang, diikuti dengan pencucian dengan washing buffer (0.2 g KCl, 0,2 g KH2PO4, 500 µL Tween, 1.15 g Na2HPO4, dan 37.5 g NaCl dalam 1 L akuabidest). Konjugat rabbit anti-chickhen IgY (IgG)yang dilabel Horseradish Peroxidase (HRP) (Sigma no catalog #A9046) dengan pengenceran 1/2500 lalu ditambahkan, kemudian diinkubasikan selama 2 jam pada suhu ruang. Kemudian dilakukan pencucian dengan washing buffer sebanyak lima kali. Substrat ABTS lalu ditambahkan, kemudian diinkubasikan selama 15 menit dan dilakukan pembacaan OD (Optical Density) dengan ELISA reader pada panjang gelombang 420 nm.
Purifikasi IgY dari Kuning Telur
Prosedur purifikasi IgY yang dilakukan mengikuti metode yang dilakukan Jenesius dan Koch (1997). Kuning telur dari setiap ayam dipisahkan dari putih telur, kemudian dilarutkan dalam TBS-Tween dengan perbandingan 1:4. Kemudian larutan tersebut disentrifugasi pada kecepatan 3000 x g selama 30 menit. Dekstran sulfat 10% sebanyak 120 µL/mL supernatan ditambahkan kemudian diikuti 50 µL CaCl2 1 M. Kemudian dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 3000 x g selama 30 menit, apabila supernatan yang dihasilkan belum jernih dilakukan penambahan dekstran sulfat dan CaCl2 serta sentrifugasi kembali sampai menghasilkan supernatan yang jernih. Supernatan yang jernih menunjukkan tidak ada lagi lemak yang terdapat di dalamnya.
Purifikasi IgY dilakukan dengan presipitasi sodium sulfat. Metode ini merupakan pilihan utama karena menghasilkan IgY dalam bentuk paling murni dibandingkan metode-metode lainnya. Purifikasi diawali dengan menambahkan 20 g Na2SO4 secara perlahan pada telur delipidasi sambil distir. Suspensi kemudian disentrifugasi pada kecepatan 3000 x g selama 20 menit. Platelet yang didapat lalu dilarutkan dalam 10 mL TBS dan disentrifugasi kembali untuk diambil supernatannya. Supernatan kemudian distir sambil ditambahkan 8 mL Na2SO4 36% pada suhu 40oC. Jika suspensi yang terbentuk berwarna keruh, hal itu menunjukkan terdapat protein didalamnya. Kemudian dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 3000 x g selama 20 menit. Platelet yang didapat kemudian dilarutkan dalam PBS dan didialisis terhadap PBS. Kemurnian IgY yang berhasil dipurifikasi kemudian divalidasi dengan SDS PAGE dan
Immunobloting.Konsentrasi protein dalam larutan tersebut dihitung dengan metode Bradford.Titer IgY antilipase diukur dengan ELISA.
Identifikasi Kemurnian IgY dengan SDS PAGE dan Immunoblotting
Gel hasil elektroforesis ditransfer ke transfer buffer (3.02 g Tris, 14.4 g glisin, dan 200 mL metanol dalam 1 L akuabidest). Kertas transfer lalu diletakkan diatas gel selama 15 menit, kemudian dialiri arus listrik 350 mA dengan voltase 100 V selama 60 menit. Metode ini dinamakan electrophoretic elution dengan sistem wet transfer. Kertas transfer (pure nitrocellulose membrane 0.45 µm) lalu diwarnai dengan Ponceaus 0.01% kemudian dibloking dengan non fat milk 5% dalam PBS selama 24 jam. Kertas transfer lalu dicuci TBS-T (Tris Buffer Saline
yang mengandung 0.05% Tween, pH 7.4) sebanyak 4 kali. Kemudian konjugat
rabbit anti-chickhen IgY (IgG)yang dilabel peroxidase dengan pengenceran 1/5000 ditambahkan pada kertas transfer sambil digoyang-goyang selama 90 menit. Kertas transfer lalu dicuci dengan TBS-T sebanyak 4 kali, kemudian direaksikan dengan substrat Diaminobenzidine (0,006 µL DAB, 10 µL H2O2, dan 10 mL Tris 50 mM pH 7.6).
Pengukuran titer IgY Antilipase dengan ELISA
Teknik ELISA yang digunakan sesuai dengan Akita dan Nakai (1994) dengan beberapa modifikasi. Enzim lipase 8 µg/mL dicoating pada ELISA plate, kemudian diinkubasikan pada suhu 4oC selama 24 jam. Kemudian dilakukan bloking dengan susu skim (non dried fat milk) 50 mg/mL untuk menutupi bagian sumur yang tidak dicoating agar tidak berikatan dengan antibodi. IgY antilipase dengan pengenceran 1/200 dimasukkan ke lajur pertama, kemudian diencerkan secara serial. Kemudian diinkubasikan selama 2 jam pada suhu ruang, diikuti dengan pencucian dengan washing buffer (0.2 g KCl, 0,2 g KH2PO4, 500 µL Tween, 1.15 g Na2HPO4, dan 37.5 mg NaCl dalam 1 L akuabidest). Konjugat
rabbit IgG antichickhen yang dilabel Horseradish Peroxidase (HRP) dengan pengenceran 1/2500 lalu ditambahkan, kemudian diinkubasikan selama 2 jam pada suhu ruang. Kemudian dilakukan pencucian dengan washing buffer sebanyak lima kali. Substrat ABTS lalu ditambahkan, kemudian diinkubasikan selama 15 menit dan dilakukan pembacaan OD (Optical Density) dengan ELISA reader pada panjang gelombang 420 nm.
Uji In Vitro Penghambatan Aktivitas Enzim Lipase
Uji in vitro menggunakan modifikasi metode colorimetric microplate assay yang dilakukan Choi et al. (2003). Aktivitas penghambatan dilihat pada empat kelompok, yaitu IgY antilipase, Xenical® (orlistat) sebagai kontrol positif, IgY dari telur kontrol (tidak diimunisasi), dan tanpa inhibitor. Konsentrasi IgY (antilipase dan kontrol) dan orlistat yang digunakan didasarkan atas perbandingan molaritas (molar ratio) antara IgY dan orlistat terhadap enzim lipase. Dengan mengetahui perbandingan tersebut, konsentrasi dimana IgY dan orlistat memiliki jumlah yang sama dengan lipase akan didapat. Substrat yang digunakan adalah DMPTB (2,3-dimercapto-1-propanol tributyrate). DMPTB akan dihidrolisis oleh lipase sehingga terjadi pelepasan gugus thiol dari DMPTB. Gugus thiol tersebut akan bereaksi dengan TNB (5-thio, 2-nitrobenzoat). TNB merupakan hasil reduksi DTNB (((5,5’-dithiobis(2-nitro benzoic acid) oleh lipase. Reaksi tersebut ditandai dengan perubahan warna menjadi kuning
Enzim lipase dengan konsentrasi 0,5 mg/mL dalam buffer L (10 mM KCl, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5) ditambahkan sebanyak 10 µL. Setiap inhibitor diencerkan secara serial, IgY antilipase dan IgY kontrol diencerkan dari 5 mg/mL sampai 0,078125 mg/mL sedangkan orlistat diencerkan dari 50 µg/mL sampai 0,78125 µg/mL. Kemudian ditambahkan sebanyak 10 µL. ELISA plate
kemudiandiinkubasikan pada suhu 37oC selama 30 menit supaya terjadi ikatan yang kuat antara lipase dan IgY antilipase. Sebanyak180 µ L pereaksi campuran (20 µL 10 mM DMPTB, 20 µL DTNB 40 mM, 2 µL EDTA 1 mM, 2 µL Triton X-100, dan 50 µL Tris-Cl 1 M dengan 803 µL air deionisasi) kemudian ditambahkan ke setiap sumur. ELISA plate laludiinkubasikan pada suhu 37oC selama 30 menit, kemudian dilakukan pembacaaan dengan ELISA reader pada panjang gelombang 405 nm. Aktivitas penghambatan enzim lipase sampel diukur dengan rumus:
Aktivitas penghambatan = ODkontrol-– ODsampel
x 100% OD
kontrol-Uji In Vivo Penghambatan Absorbsi Lemak di Saluran Pencernaan Kelinci Sebelum mendapat perlakuan, 12 ekor kelinci diaklimasi selama 1 minggu dengan menggunakan antibiotik enrofloksasin 5 mg/kg bobot badan (BB) 2x sehari selama 3 hari, ivermectine 0,2-0,44 mg/kg BB secara subkutan (SC) sebagai antiektoparasit, dan mebendazole 50 mg/kg BB secara peroral (PO) sebagai antiendoparasit. Pada tahap ini, semua kelinci diberi ransum standar (Indo Feed® K-03 Super) dan minum ad libitum. Sebelum diberi perlakuan, kelinci ditempatkan pada masing-masing kandangnya, kelinci ditimbang bobotnya untuk mengetahui bobot badannya. Selanjutnya hewan percobaan secara acak dibagi menjadi 4 kelompok perlakuan yang masing-masing terdiri atas 3 ekor kelinci. Adapun kelompok perlakuan adalah sebagai berikut:
Kelompok 1. Merupakan kelompok kontrol negatif. Kelompok ini hanya diberi pakan standar 50 g/ekor 2 kali sehari.
Kelompok 2. Merupakan kelompok kontrol positif. Kelompok ini diberi pakan standar 50 g/ekor dan kuning telur 5 g/ekor 2 kali sehari.
Kelompok 3. Merupakan kelompok yang diberi pakan standar 50 g/ekor, kuning telur 5 g/ekor dan orlistat (Xenical®) 5,285 mg/kg BB/ekor 2 kali sehari. Orlistat diberikan 1 jam setelah makan.
Kelompok 4. Merupakan kelompok yang diberi pakan standar 50 g/ekor, kuning telur 5 g/ekordan kuning telur yang mengandung IgY antilipase 2 g/ekor 2 kali sehari secara bersamaan.
Perhitungan dosis orlistat didasarkan pada perbandingan luas permukaan tubuh (Laurence dan Bacharach 1964). Rumus perbandingan dosis disajikan sebagai berikut:
Dosis untuk kelinci 1,5kg (mg/kg) =
Dosis manusia dewasa (mg/kg) x
Faktor konversi manusia ke kelinci (0,07)
Dosis untuk kelinci 1,5 kg = 120 mg/kg x 0,07 Dosis untuk kelinci = 8,4 mg/1,2 kg Dosis untuk kelinci = 5,6 mg/kg BB
Sebelum perlakuan, semua kelinci diaklimasi selama 1 minggu dengan menggunakan antibiotik enrofloksasin 5 mg/kg bobot badan (BB) 2x sehari selama 3 hari, ivermectine 0,2-0,44 mg/kg BB secara subkutan (SC) sebagai antiektoparasit, dan mebendazole 50 mg/kg BB secara peroral (PO) sebagai antiendoparasit. Seminggu setelah aklimasi dilakukan pemeriksaan fisik untuk memastikan bahwa semua kelinci yang akan digunakan berada dalam kondisi sehat. Setelah semua kelinci dipastikan berada dalam kondisi sehat, perlakuan dilakukan selama 1 minggu. Satu hari sesudah perlakuan dilakukan pengumpulan feses dari setiap individu untuk kemudian dilakukan pengukuran kadar lemak feses dengan metode sokhletisasi. Absorbsi lemak di saluran pencernaan dihitung dari selisih lemak pakan dengan lemak feses.
Analisis Kimia Feses
Analisis Kadar Air dengan Metode Oven
Analisis kadar air dengan metode oven dimulai dengan mengeringkan cawan/botol timbang beserta tutupnya dalam oven 105 ± 2oC selama 15 menit kemudian didinginkan di dalam desikator lalu ditimbang sampai ketelitian 0,1 mg. Sebanyak 3-5 g feses dimasukkan ke dalam cawan kemudian dikeringkan dalam oven 105 ± 2oC selama 3 jam kemudian didinginkan di dalam desikator selama 15-30 menit. Cawan beserta sampel kemudian ditimbang sampai ketelitian 0,1 mg dan dilakukan penetapan blanko. Rumus penghitungan kadar air dilakukan dengan persamaan:
Kadar air = w1– w2
x 100 % w1– w0
dimana w0: bobot cawan
w1: bobot cawan + sampel sebelum dikeringkan (g) w2: bobot cawan + sampel sesudah dikeringkan (g)
Analisis Kadar Lemak dengan Metode Soxhlet
Analisis kadar lemak dimulai dengan menghaluskan sampel feses hingga ukurannya <1 mm. Kemudian sampel tersebut ditimbang sebesar 2-4 g lalu dimasukkan ke dalam thimble dan ditutup dengan kapas agar tidak bocor. Thimble
berisi sampel kemudian dimasukkan ke dalam alat Soxhlet dan diekstrak selama 4 jam, lalu labu lemak berisi residu lemak disuling dan dikeringkan dalam oven 105oC sampai tidak berbau pelarut selama 3 jam kemudian didinginkan dalam desikator selama 30-45 menit. Kemudian labu berisi lemak ditimbang dan dikerjakan blanko. Rumus penghitungan kadar lemak dilakukan dengan persamaan:
Kadar lemak = w1– w2
x 100 % w1– w0
dimana w0 : bobot labu (g)
w1: bobot labu + sampel sebelum ekstraksi (g) w2: bobot labu + residu minyak setelah ekstraksi (g)
Prosedur Analisis Data
Data inhibisi aktivitas lipase pankreas, kadar lemak feses, persentase dan jumlah lemak pakan yang dicerna yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam (ANOVA) dan jika terdapat perbedaan yang nyata dilanjutkan dengan uji Duncan.