Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Cendawan dan Laboratorium Biologi Balai Besar Pengembangan Pengujian Mutu Benih Tanaman Pangan dan Hortikultura Cimanggis - Depok dan Lahan Percobaan Balai Penelitian Tanaman Hias Cipanas - Cianjur. Penelitian ini dimulai dari bulan Maret 2014 sampai dengan Agustus 2015.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : sampel benih gandum bersertifikat yang terdiri dari lima varietas yaitu varietas Selayar, Nias, Dewata, Guri 1, Guri 2. Bahan-bahan lain diantaranya adalah : aquades, alkohol, media PDA, minyak cengkeh, minyak sereh wangi dan kertas saring steril.
Alat yang digunakan antara lain adalah : cawan petri, tabung reaksi, pinset, kaca pembesar, mikrowave, tabung erlenmeyer, mikroskop stereo dan mikroskop
compound.
Metode Penelitian Sampel Pengujian
Sampel benih gandum yang digunakan untuk seluruh tahapan pengujian penelitian didapatkan dari Balai Penelitian Tanaman Serealia (Balitsereal) Maros yang terdiri atas lima varietas yaitu : varietas Nias, Dewata, Selayar, Guri 1 dan Guri 2. Sampel benih dalam pengujian merupakan benih sumber dari kelas benih BS (Breeder Seed) label kuning hasil dari perbanyakan pemulia tanaman yang dipanen pada bulan Oktober 2013.
9
Deteksi dan Identifikasi Cendawan Terbawa Benih Gandum Tropis
Deteksi cendawan dengan menggunakan metode inkubasi pada metode
blotter test dan media agar mengacu pada ISTA (2010).
Identifikasi cendawan dilakukan melalui pengamatan morfologi yaituwarna koloni, ada/tidak sekat, dan bentuk konidia. Identifikasi mengacu pada buku
Illustrated Genera of infected Fungi (Burnet dan Hunter 1972), An Illustrated Manual on Identification of some Seed borne Aspergillus, Fusaria, Penicillia and their Mycotoxins (Sing et al. 1991), Pictorial Atlas of Soil and Seed Fungi
(Watanabe 1994), Seed Health Testing Methods for Detecting Fungi (Mathur and Kongsdal 2003) dan The Identification of fungi (Dugan 2006).
a. Metode blotter test
Setiap sampel untuk blotter test terdiri atas 200 benih gandum yang terdiri atas lima varietas yaitu varietas Nias, Dewata, Selayar, Guri 1 dan Guri 2. Pengujian dilakukan dengan cara meletakkan benih diatas dua sampai tiga lembar kertas saring steril yang telah dilembapkan dengan air steril. Benih gandum kemudian diinkubasi pada inkubator dengan suhu 20-25 ºC selama 24 jam kemudian dipindahkan ke freezer pada suhu -20±2 ºC selama 24 jam. Selanjutnya diinkubasi pada inkubator dengan suhu 20-25 ºC yang dilengkapi lampu NUV 12 jam terang dan 12 jam gelap secara bergantian selama 7 hari (Gambar 2).
Parameter yang diamati pada pengujian yaitu tingkat infeksi cendawan terbawa benih yang dilakukan dengan pengamatan morfologi cendawan terbawa benih dengan mikroskop stereo dan mikroskop compound.
Gambar 2 Tahapan blotter test: a) benih gandum yang akan diuji, b) kertas saring steril yang dilembapkan dengan air steril, c) benih disebarpada cawan petri, d) benih pada freezer -20±2 ºC, e) benih diinkubasi pada inkubator dengan suhu 20-25 ºC, f) pengamatan dengan mikroskop
10
Tingkat infeksi dihitung dalam persen dengan rumus :
Ʃ benih terinfeksi cendawan tertentu
Tingkat Infeksi = x 100% Ʃ benih yang diuji
b. Media Agar
Pengujian benih dilakukan dengan cara terlebih dahulu benih disterilisasi permukaan menggunakan larutan NaOCl 1% selama 3 menit, kemudian dibilas dengan air steril, dan dikeringanginkan pada kertas saring steril. Benih diletakkan pada media PDA. Setiap cawan petri berisi 10 butir benih, selanjutnya benih diinkubasikan pada inkubator selama 4 hari dengan penyinaran lampu NUV 12 jam terang dan 12 jam gelap secara bergantian.
Pengamatan dilakukan dengan menggunakan mikroskop stereo dan mikroskop compound. Cendawan yang ditemukan pada benih gandum dicatat dan selanjutnya dilakukan pemurnian isolat dan disimpan pada agar miring. (Gambar 3).
Gambar 3 Tahapan deteksi dengan media agar: a) benih gandum yang akan diuji, b) benih disterilisasi permukaan dengan menggunakan NaOCl 1%, c) benih dibilas dengan air steril, d) benih dikeringanginkan dan diletakkan diatas kertas saring steril, e) benih disebar pada media PDA, f) benih di inkubasi pada inkubator
Uji Patogenisitas pada Benih Gandum
Pengujian patogenisitas isolat cendawan terbawa benih gandum dilakukan dengan menggunakan benih gandum. Pengujian dilakukan dengan cara 10 benih gandum diletakkan pada isolat murni cendawan berumur 5-7 hari pada media PDA di dalam cawan petri, kemudian diinkubasi selama 7 hari. Sebelum
11 pengujian benih terlebih dahulu disterilisasi permukaan dengan NaOCl 1% selama 3 menit.
Isolat cendawan dikategorikan sebagai patogen jika menyebabkan pertumbuhan kecambah yang tidak normal atau menunjukkan gejala kerusakan (nekrotik). Jika kecambah tumbuh normal seperti pada benih yang ditumbuhkan pada media PDA tanpa cendawan uji dikategorikan sebagai cendawan non patogen. (Gambar 4).
Gambar 4 Uji patogenisitas pada media Potato Dekstrosa Agar (PDA): a) isolat murni pada media PDA, b) benih disterilisasi permukaan dengan menggunakan NaOCl 1%, c) benih dibilas dengan air steril, d) benih dikeringanginkan dan diletakkan diatas kertas saring steril, e) benih disebar pada isolat murni cendawan yang berumur 5-7 hari pada media PDA, f) Inkubasi pada inkubator
Uji Transmisi Metode Growing on Test pada Media Agar
Pada uji transmisi pada media agar dilakukan berdasarkan ISTA 2010. Media tumbuh agar air steril disiapkan dalam cawan petri steril. Sebanyak 200 benih dari satu contoh benih diberi perlakuan sterilisasi permukaan dengan NaOCl 1% selama 3 menit, kemudian benih dibilas dengan air steril, dikeringanginkan pada kertas saring steril. Benih diletakkan pada media agar dalam cawan petri. Tiap cawan ditanami 10 butir benih. Benih diinkubasikan pada suhu ruangan selama 7 hari dengan penyinaran lampu NUV 12 jam terang dan 12 jam gelap secara bergantian. Pengamatan dengan mikroskop stereo dilakukan pada hari ke-7 tetapi dapat pula dilakukan mulai hari ke-4, bila koloni cendawan sudah mulai tumbuh. Cendawan yang tumbuh diisolasi dan dimurnikan, selanjutnya disimpan pada agar miring untuk digunakan lebih lanjut.
12
Perlakuan Benih
Pengujian perlakuan benih terdiri atas dua perlakuan yaitu: (1) Perlakuan fisik dengan menggunakan gelombang pendek yang terdiri dari empat taraf yaitu 0, 10, 20, 30 dan 45 detik; dan (2) perlakuan dengan menggunakan ekstrak bahan alami menggunakan minyak cengkeh dan minyak sereh wangi yang terdiri atas empat konsentrasi yaitu 0.1, 0.25, 1.0, 2.0 dan 5.0% dan kontrol tanpa perlakuan minyak.
Gelombang Pendek
Pada pengujian perlakuan benih dengan gelombang pendek mengacu pada (Gaurilcikiene et al. 2013) yang telah dimodifikasi berdasarkan perubahan waktu. Benih gandum yang digunakan terdiri atas lima varietas yaitu varietas Nias, Dewata, Guri 1 dan Guri 2 adalah benih murni yang telah dipisahkan dari benih rusak dan kotoran. Sebanyak 200 benih gandum dari setiap varietas yang diuji dimasukkan dalam cawan petri, kemudian diberi perlakuan fisik dengan cara dipanaskan dengan gelombang pendek selama 10, 20, 30 dan 45 detik dengan suhu pemanasan pada level rendah. Kemudian benih dikecambahkan menggunakan metode blotter test dan metode UKDdp (Uji kertas digulung didirikan dalam plastik). (Gambar 6 dan 7)
Gambar 5 Perlakuan fisik menggunakan gelombang pendek: a) benih gandum, b) pemanasan dengan mikrowave
a. Metode blotter test
Sebanyak 200 benih gandum yang terdiri atas lima varietas yaitu Nias, Dewata, Selayar, Guri 1 dan Guri 2 yang telah diberi perlakuan gelombang pendek disebar dalam cawan petri. Sebelum benih disebar, pada cawan petri dilapisi dengan 2 sampai 3 lembar kertas saring steril yang dibasahi dengan air steril. Selanjutnya benih diinkubasi pada suhu 20-25 ºC selama 24 jam kemudian dipindahkan ke freezer pada suhu -20±2 ºC selama 24 jam dan kembali diinkubasi pada inkubator dengan suhu 20-25 ºC dengan penyinaran lampu near ultraviolet
(NUV) selama 12 jam terang dan 12 jam gelap secara bergantian. Identifikasi dilakukan setelah 7 hari inkubasi (Gambar 6).
13
Gambar 6 Tahapan blotter test pada benih gandum yang telah diberi perlakuan: a) benih gandum yang telah diberi perlakuan dan akan disebar pada cawan petri, b) kertas saring steril yang telah dilembapkan dengan air steril, c) benih yang disebar pada cawan petri, d) benih pada freezer -20±2 ºC, e) benih diinkubasi pada inkubator dengan suhu 20-25 ºC, f) pengamatan dengan mikroskop stereo
Parameter yang diamati pada pengujian ini yaitu tingkat infeksi cendawan patogen setelah masa inkubasi. Kemudian dilanjutkan dengan perhitungan tingkat efikasi. Pengamatan tingkat infeksi dilakukan secara makroskopis menggunakan mikroskop stereo dan mikroskopis dengan menggunakan mikroskop compound
terhadap karakteristik pertumbuhan dan struktur cendawan. Tingkat infeksi dihitung dalam persen dengan rumus :
Ʃ benih terinfeksi cendawan tertentu
Infeksi = x 100%
Ʃ benih yang diuji Tingkat efikasi dihitung dalam persen dengan rumus : Ʃ Kontrol - Ʃ Perlakuan
Tingkat Efikasi = x 100%
14
b. Metode UKDdp (Uji Kertas Digulung didirikan dalam plastik)
Pada metode UKDdp mengacu pada Sadjad (1993). Sebanyak 200 benih gandum yang terdiri dari lima varietas yaitu Nias, Dewata, Selayar, Guri 1 dan Guri 2 diletakkan diatas 2 sampai 4 lembar kertas merang yang telah dilembapkan kemudian digulung dan dilapisi dengan selembar plastik. Setiap unit pengujian dengan menggunakan metode UKDdp selanjutnya seluruh unit pengujian dimasukan dalam germinator suhu berganti 20-30 ºC untuk menjaga agar kondisi perkecambahan tetap optimum. Pengamatan dilakukan 2 kali yaitu pada hari ke-4 dan hari ke-8. Benih diamati terhadap daya berkecambah yang meliputi benih normal, abnormal, benih mati dan segar tidak tumbuh.
Gambar 7 Tahapan metode UKDdp: a) benih gandum yang telah diberi perlakuan fisik dengan gelombang pendek, b), c), d) dan e) benih disebar pada kertas merang dengan dilapisi selembar plastik, f) benih diinkubasi pada germinator suhu berganti 20-30 ºC
Parameter yang diamati pada pengujian ini daya berkecambah. Pengamatan daya berkecambah (DB) perhitungannya dilakukan berdasarkan persentase kecambah normal (KN) pada pengamatan pertama dan kedua. Pengamatan pertama pada hari ke-4 setelah tanam (KN hitungan I) dan pengamatan kedua pada hari ke-8 setelah tanam (KN hitungan II). Nilai Daya Berkecambah (DB) dihitung dengan rumus:
Ʃ KN hitungan I + Ʃ KN hitungan II
DB% = x 100%, dengan
Ʃ benih yang ditanam
15
Minyak cengkeh
Pada pengujian perlakuan benih dengan minyak cengkeh mengacu pada Ilyas et al. 2007 dan Astuti (2009) yang telah dimodifikasi. Sebanyak 200 benih gandum dari lima varietas yaitu varietas Nias, Dewata, Selayar, Guri 1, Guri 2 direndam selama 1 jam dengan minyak cengkeh dengan konsentrasi 0.1, 0.25, 1.0, 2.0 dan 5.0% dan kontrol tanpa perlakuan minyak, kemudian benih dikeringanginkan selama 48 jam (Gambar 8). Selanjutnya benih dikecambahkan dengan menggunakan metode blotter test dan metode UKDdp.
Gambar 8 Perlakuan benih dengan menggunakan minyak cengkeh : a) benih gandum yang terdiri dari lima varietas, b) konsentrasi minyak cengkeh, c) benih direndam selama 1 jam pada suhu kamar, d) benih dikeringanginkan selama 48 jam dengan menggunakan blower
Pada tahapan blotter test dan metode UKDdp untuk perlakuan minyak cengkeh serta parameter yang diamati sama seperti pada perlakuan benih secara fisik dengan menggunakan gelombang pendek (Gambar 6 dan 7).
Minyak sereh wangi
Pada pengujian perlakuan benih dengan minyak sereh wangi mengacu pada Ilyas et al. 2007 dan Astuti (2009) yang telah dimodifikasi. Sebanyak 200 benih gandum dari lima varietas yaitu varietas Nias, Dewata, Selayar, Guri 1, Guri 2 direndam selama 1 jam dengan konsentrasi 0.1%, 0.25%, 1.0%, 2.0% dan 5.0% dan kontrol tanpa perlakuan minyak, kemudian benih dikeringanginkan selama 48 jam (Gambar 9). Selanjutnya benih dikecambahkan dengan menggunakan metode
16
Gambar 9 Perlakuan benih menggunakan minyak sereh wangi : a) benih gandum yang terdiri dari lima varietas, b) konsentrasi minyak sereh wangi, c) benih direndam selama 1 jam pada suhu kamar, d) benih dikeringanginkan selama 48 jam dengan menggunakan blower
Pada tahapan blotter test dan metode UKDdp untuk perlakuan minyak sereh wangi serta parameter yang diamati sama seperti pada perlakuan benih secara fisik dengan menggunakan gelombang pendek (Gambar 6 dan 7).
Pengujian Growing on Test di Lahan Percobaan
Pada pengujian growing on test di lahan percobaan, dilakukan dengan cara mengambil hasil terbaik dari perlakuan benih yang diuji secara in vivo kemudian diaplikasikan di lapangan. Pada pengujian growing on test di lapangan terdiri atas lima perlakuan yaitu: 1) perlakuan fisik dengan menggunakan gelombang pendek, dengan lama pemanasan 10 detik; 2) perlakuan minyak cengkeh pada konsentrasi 0.1%; 3) perlakuan minyak sereh wangi pada konsentrasi 0.1%; 4) kontrol positif dengan menggunakan fungisida dan 5) kontrol negatif tanpa perlakuan. Sampel benih varietas gandum yang digunakan pada pengujian growing on test terdiri dari tiga varietas yaitu varietas Nias, Guri 1 dan Guri 2.
Benih setelah diberi perlakuan, kemudian di tabur pada polybag berukuran 35 x 35cm, yang terdiri dari lima blok dan tiap blok terdiri dari 15 satuan percobaan yang diacak. Setiap satuan percobaan diulang sebanyak lima kali. Setiap polybag ditanami 3 butir benih, diatur sesuai dengan tata letak plot perlakuan pada percobaan growing on test di lahan percobaan (Lampiran 9 ).
Pengamatan pada pengujian ini dilakukan sampai 30 hari setelah tanam. Parameter yang diamati adalah tingkat gejala yang disebabkan oleh perlakuan yang diberikan selama fase pembibitan dihitung dalam persen tanaman sakit sebagai berikut :
17
Ʃ bibit yang bergejala
Tanaman Sakit (%) = x 100% Ʃ benih yang ditanam