BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.3 Ekstrak dan Ekstraksi
2.3.3 Metode Isolasi
Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani Rusia, Michael Tswett pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas yang berisi kalsium karbonat (CaCO3) (Ganjar & Rohman, 2007). Kromatografi
merupakan metode pemisahan fisikokimia untuk memisahkan campuran senyawa berdasarkan perbedaan waktu huni komponen campuran dalam sistem fase diam dan fase gerak (Hostettman, et al., 1995).
Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fase, yaitu fase diam (stationer) dan fase gerak (mobile). Fase diam bertindak sebagai zat penjerap seperti alumina, silika gel, dan resin penukar ion atau bertindak melarutkan zat terlarut seperti pada kromatografi kertas. Fase gerak membawa zat terlarut melalui fase diam dengan kecepatan tergantung pada daya ikat setiap zat terlarut terhadap kedua fase. Prinsip pemisahan kromatografi yaitu adanya distribusi komponen-komponen dalam fase diam dan fase gerak berdasarkan sifat fisik komponen yang akan dipisahkan (Harbone, 1996).
2.3.3.2Kromatografi Lapis tipis
Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan salah satu metode pilihan kromatografi secara fisikokimia (Gandjar & Rohman, 2007). KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Pada KLT fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat alumunium atau plat plastik. Meskipun demikian, kromatografi planar ini merupakan bentuk terbuka dari kromatografi kolom (Gritter, et al., 1991).
KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif atau preparatif. Kedua dipakai untuk menjajaki sistem
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom (Gritter, et al., 1991).
Kromatografi lapis tipis (KLT) dapat digunakan untuk tujuan analitik dan preparatif. KLT analitik digunakan untuk menganalisa senyawa-senyawa organik dalam jumlah kecil misalnya, menentukan jumlah komponen dalam campuran dan menentukan pelarut yang tepat untuk pemisahan dengan KLT preparatif. Sedangkan KLT preparatif digunakan untuk memisahkan campuran senyawa dari sampel dalam jumlah besar berdasarkan fraksinya, yang selanjutnya fraksi-fraksi tersebut dikumpulkan dan digunakan untuk analisa berikutnya (Townshend, 1995).
Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang atau cairan pengelusi akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara mekanik (ascending), atau karena pengaruh grafitasi pada pengembang menurun (descending) (Gritter, et al., 1991).
Jumlah volume fase gerak harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng yang telah ditentukan. Setelah lempeng terelusi, dilakukan deteksi bercak. Laju pergerakan fase gerak terhadap fase diam dihitung sebagai retardation farctor (Rf). Nilai Rf diperoleh dengan membandingkan jarak yang ditempuh oleh zat terlarut dengan jarak yang ditempuh oleh fase gerak (Gandjar & Rohman, 2007).
Fase gerak harus memiliki kemurnian yang tinggi. Hal ini dikarenakan KLT merupakan teknik yang sensitif. Fase gerak yang digunakan adalah pelarut organik yang memiliki tingkat polaritas tersendiri, melarutkan senyawa contoh, dan tidak bereaksi dengan penjerap (Gritter, et al., 1991).
a. Fase Diam
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 mikrometer. Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi utama pada KLT adalah partisi dan adsorpsi (Ganjar & Rohman, 2007). Adsorben umum yang digunakan dalam KLT meliputi partikel silika
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta gel ukuran 12 µm, alumina, mineral oksida, silikagel dengan ikatan kimia, selulosa, poliamida, polimer penukar ion, silikagel, danfase kiral (Gocan, 2002).
Tabel 2.1 Fase Diam Kromatografi Lapis Tipis
Penjerap Mekanisme sorbsi Penggunaan
Silika gel Adsorpsi Asam amino, hidrokarbon,
vitamin, alkaloid. Silika yang dimodifikasi dengan hidrokarbon Partisi termodifikasi
Senyawa-senyawa non polar
Serbuk selulosa Partisi Asam amino, nukleotida,
karnohidrat.
Alumina Adsorpsi Hidrokarbon, ion logam, pewarna
makanan, alkaloid. Kieselguhr (tanah
diatomae)
Partisi Gula, asam-asam lemak.
Selulosa penukar ion Pertukaran ion Asam nukleat, nukleotida, halida dan ion-ion logam.
Gel sephadex Eksklusi Polimer, protein, kompleks
logam.
�-siklodekstrin Interaksi adsorpsi stereospesifik
Campuran enansiomer.
b. Fase Gerak
Pada kromatografi KLT umumnya fase gerak yang digunakan adalah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Adapun petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak (Ganjar & Rohman, 2007):
- Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif.
- Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
- Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.
- Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia masing-masing akan meningkatkan solut-solut yang bersifat basa dan asam.
c. Penotolan Sampel
Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Untuk memperoleh reprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 mikroliter. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 mikroliter maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan. Penotolan yang tidak tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar dan puncak ganda (Ganjar & Rohman, 2007).
d. Pengembangan
Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampel tersebut dalam suatu bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan fase gerak. Tepi bagian bawah lempeng lapis tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan ke dalam bejana berisi fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus di bawah lempeng. Ada beberapa teknik untuk pengembangan dalam kromatografi lapis tipis, yaitu pengembangan menaik (ascending), menurun (descending), melingkar dan mendatar (Ganjar & Rohman, 2007).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta e. Deteksi Bercak
Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna. Untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika, dan biologi. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan pencacahan radioaktif dan fluoresensi sinar ultraviolet. Fluoresensi sinar ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas. Jika senyawa tidak dapat berfluoresensi maka bahan penyerapnya akan diberi indikator yang berfluoresensi, dengan demikian bercak akan kelihatan hitam sedang latar belakangnya akan kelihatan berfluoresensi (Ganjar & Rohman, 2007).
2.3.3.3Identifikasi Kromatogram
Ada beberapa cara untuk mendeteksi senyawa yang tidak berwarna pada kromatogram. Deteksi paling sederhana adalah jika senyawa menunjukkan penyerapan di daerah UV gelombang pendek (radiasi utama kira-kira 254 nm) atau jika senyawa itu dapat dieksitasi pada radiasi UV gelombang pendek dan gelombang panjang (365 nm). Pada senyawa yang mempuyai dua ikatan rangkap atau lebih dan senyawa aromatik seperti turunan benzena, mempunyai serapan kuat ± di daerah 230-300 nm (Stahl, 1985).
Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah dari lapisan tipis menggunakan harga Rf. Harga Rf didefinisikan sebagai berikut (Sastrohamidjojo, 2005).
Jarak yang digerakkan oleh senyawa dari titik asal Rf :
Jarak yang digerakkan oleh pelarut dari titik asal
Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga standar. Nilai-nilai Rf yang diperoleh hanya berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun demikian daftar
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dari harga-harga untuk berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat diperoleh (Sastrohamidjojo, 2005).
2.3.3.4 Sistem Fase Gerak pada KLT
Polaritas fase gerak perlu diperhatikan pada analisa dengan KLT, sebaiknya digunakan campuran pelarut organik yang mempunyai polaritas serendah mungkin. Campuran yang baik memberikan fase gerak yang mempunyai kekuatan bergerak sedang. Secara umum dikatakan bahwa fase diam yang polar akan mengikat senyawa polar dengan kuat sehingga bahan yang kurang sifat kepolarannya akan bergerak lebih cepat dibandingkan bahan-bahan polar (Gritter, et al., 1991).
Fase gerak harus memiliki kemurnian yang tinggi. Hal ini dikarenakan KLT merupakan teknik yang sensitif. Fase gerak yang digunakan adalah pelarut organik yang memiliki tingkat polaritas tersendiri, melarutkan senyawa contoh, dan tidak bereaksi dengan penjerap (Gritter, et al., 1991).
Pelarut yang ideal harus melarutkan linarut dan harus cukup baik sebagai pelarut yang bersaing dengan daya serap penjerap. Keadaan yang ideal tersebut mungkin terjadi jika pelarut tidak berproton seperti hidrokarbon, eter dan senyawa karbonil dipakai sebagai pelarut pengembang (Gritter, et al., 1991).
2.3.3.5Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi (Gritter, et al., 1991). Kromatografi kolom membutuhkan zat terlarut yang terdistribusi diantara dua fase, satu diantaranya fase diam dan yang lainnya fase gerak. Fase gerak membawa zat terlarut melalui media, hingga terpisah dari zat terlarut lain yang terelusi lebih awal atau akhir. Umumnya zat terlarut dibawa melewati media pemisah oleh aliran suatu pelarut berbentuk cairan atau gas yang disebut pelarut (Harborne, 1987).
Sistem elusi pelarut yang digunakan dalam kolom kromatografi ada 3 yaitu: isokratik, fraksional, dan gradient. Pada proses elusi isokratik
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta menggunakan komposisi pelarut yang tidak berubah sampai proses elusi selesai. Pada proses elusi fraksional, pelarut yang digunakan hanya satu jenis. Sedangkan pada elusi gradient, pelarut yang digunakan dengan konsentrasi bertingkat (Smith, F. J. dan A. Braithwaite, 1999).
Pada kromatografi kolom, tabung pemisah diisi penjerap. Penjerap yang biasa digunakan ialah silika gel. Pengisian ini harus dilakukan secara berhati-hati dan merata. Penjerap dapat dikemas dalam tabung dengan cara basah maupun kering (Harborne, 1987). Cara basah, silika gel terlebih dahulu dijenuhkan dengan cairan pengelusi yang akan digunakan. Kemudian dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit, sambil kran kolom dibuka.
Kemudian pelarut organik (misalnya n-heksana) dialirkan hingga silika gel mampat. Setelah silika gel mampat, pelarut dibiarkan mengalir hingga batas adsorben. Kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan, cara memasukkan sampel ada dua yaitu cara basah dan cara kering. Cara basah, sampel yang dimasukkan terlebih dahulu dilarutkan dalam pelarut hingga diperoleh kelarutan yang spesifik. Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom sedikit demi sedikit hingga semua sampel masuk. Selanjutnya kran dibuka dan diatur tetesannya, serta ditambahakan dengan cairan pengelusi. Tetesan yang keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi (Gritter, et al., 1991).
Sedangkan cara kering, yaitu dengan memasukkan silika gel ke dalam kolom yang telah diberi kapas sedikit demi sedikit dan diratakan dengan alat pemampat kemudian ditambahkan dengan cairan pengelusi (Gritter, et al., 1991).
2.4 Bakteri