Prosedur Sterilisasi Permukaan dan Isolasi Bakteri Endofit Contoh tanaman
Tanaman kentang diambil bersama-sama dengan tanah bagian rizosfernya dari lokasi (1) kebun Gapoktan Multi Tani Jaya Giri Desa Cipendawa, Cipanas, Cianjur (2) kebun percobaan Balai Penelitian Tanaman Sayuran Lembang, (3) screen house di Cisurupan Garut, dan (4) lahan pertanaman kentang di Desa Mulyasari Pasirwangi Garut (Lampiran 1). Wilayah-wilayah tersebut dipilih sebagai tempat pengambilan sampel tanaman kentang karena merupakan daerah penghasil kentang di wilayah Jawa Barat. Jarak antara lokasi pengambilan sampel dan laboratorium tempat isolasi yang dapat ditempuh kurang dari 24 jam juga menjadi salah satu pertimbangan pemilihan lokasi-lokasi tersebut, sehingga kondisi sampel yang diambil tetap segar ketika diisolasi bakterinya. Diantara ketiga daerah tersebut, luas area pertanaman dan produksi kentang di dataran tinggi Garut adalah paling tinggi, sehingga wilayah ini menjadi salah satu pusat penghasil bibit kentang dan umbi kentang di Indonesia.
Tanaman kentang yang diambil berumur 6 sampai 8 minggu, dan dipilih tanaman sehat yang tumbuh di dekat tanaman yang menunjukkan gejala layu bakteri. Tanaman bersama tanah tempat tumbuhnya dimasukkan ke dalam amplop coklat besar dalam posisi berdiri, selanjutnya bagian bawah amplop dimasukkan ke dalam kantong plastik. Sampel tanaman diatur dan diletakkan dalam posisi berdiri dalam bak plastik. Kesegaran tanaman dijaga dengan cara memercikkan air mineral kemasan ke bagian tajuk dan tanahnya selama proses transportasi dari lapangan sampai ke laboratorium di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB BIOGEN) Bogor untuk diisolasi bakteri endofitnya. Sampel tanaman yang sampai di Laboratorium pada malam hari selanjutnya segera diisolasi pada hari berikutnya. Selisih waktu pengambilan sampel di lapangan dengan waktu pelaksanaan isolasi bakteri endofit tidak lebih dari 24 jam.
Optimasi sterilisasi permukaan akar
Sebanyak 24 contoh tanaman kentang (Granola) umur 5-7 minggu asal Cipanas, Lembang, dan Garut dipergunakan sebagai bahan untuk optimasi sterilisasi permukaan akar. Tanaman (8 contoh tanaman dari Garut, dan masing- masing 8 tanaman dari Cipanas dan Lembang) dibersihkan dari tanah yang menempel di daerah akar lalu dicuci dibawah air mengalir. Bagian akar dipotong dan dipisahkan dari bagian tanaman lainnya. Masing-masing sampel akar dibagi menjadi 4 bagian yang relatif sama.
Sterilisasi sampel bagian pertama dilakukan dengan urutan sebagai berikut : direndam selama 1 menit dalam 1.5% larutan bleaching komersial (BAYCLIN, Johnson Home Hygiene Product, Indonesia; mengandung 5.25% NaOCl) dibilas dengan akuades steril, direndam selama 5 menit dalam ethanol 75%, dan terakhir dibilas 2 kali dengan akuades steril. Sampel kedua disterilisasi dengan urutan berikut: direndam selama 1 menit dalam 2.5% larutan bleaching komersial, dibilas dengan akuades steril, direndam selama 5 menit dalam ethanol 75%, dan terakhir dibilas 2 kali dengan akuades steril (Gambar 4).
Sampel bagian ketiga dan keempat masing masing dimasukkan secara terpisah ke dalam mangkuk ultrasonic cleaner (ULTRA 7000, James Product Ltd. Sturminster Newton, Dorset, UK) berisi akuades steril dingin dan dilanjutkan dengan sonikasi bertahap (5 kali). Setiap tahap sonikasi dilakukan selama 2 menit dalam akuades steril dingin yang baru. Selanjutnya untuk sampel bagian ketiga dilanjutkan dengan tahapan sterilisasi seperti yang dilakukan terhadap sampel bagian pertama. Sedangkan sterilisasi sampel keempat dilanjutkan dengan tahapan sterilisasi seperti yang dilakukan terhadap sampel kedua (Gambar 4). Masing- masing bagian sampel ditiriskan diatas kertas tissue steril yang terletak di dalam cawan petri besar steril. Keberhasilan sterilisasi permukaan dicek dengan cara menginokulasikan 100 µL air bilasan terakhir dari masing-masing prosedur sterilisasi ke permukaan media Trypticase Soy Agar (TSA : TSB 30 g/L, agar-agar BIOTEK 20 g/L). Selain itu, pengecekan juga dilakukan dengan cara mengusapkan permukaan akar yang telah disterilisasi permukaannya ke media TSA. Inokulasi air bilasan dan pengusapan akar ke media TSA masing-masing dilakukan dalam tiga ulangan.
Cawan-cawan TSA tersebut tersebut di-seal menggunakan plastict wrap
selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang (29ºC-30ºC) selama 3 hari. Pengamatan dilakukan terhadap terhadap jumlah koloni yang tumbuh dari masing-masing prosedur sterilisasi permukaan akar yang telah dilakukan. Prosedur sterilisasi yang tidak menghasilkan pertumbuhan koloni mikroba dari air bilasan terakhirnya (mikroba phyloplant atau rhizosphere) pada media TSA kontrol dipilih sebagai prosedur sterilisasi sampel akar yang akan diisolasi bakteri endofitnya.
Sterilisasi permukaan batang dan daun
Tanaman dibersihkan dari tanah yang menempel, dicuci dibawah air mengalir, lalu ditiriskan diatas kertas tissue. Bagian batang dipisahkan dari bagian akar dan daunnya menggunakan gunting steril kemudian dipotong-potong dengan ukuran ± 4 cm sebelum disterilisasi. Sterilisasi dilakukan dengan cara direndam selama 1 menit dalam 2.5% larutan bleaching komersial (BAYCLIN, Johnson Home Hygiene Product, Indonesia) yang mengandung 5.25% NaOCl, dibilas dengan akuades steril, direndam selama 5 menit dalam ethanol 75%, dan terakhir dibilas 2 kali dengan akuades steril. Daun-daun (beserta tangkainya) disterilisasi dengan cara yang sama dengan cara sterilisasi bagian batang.
Konfirmasi keberhasilan proses sterilisasi dilakukan dengan cara menempelkan sesaat permukaan sampel batang atau daun (masing-masing 3 buah) ke media TSA, serta menginokulasikan air bilasan terakhir ke media TSA seperti diuraikan diatas. Jika dalam waktu 24 atau 48 jam setelah inkubasi, terdapat koloni mikroba yang tumbuh pada media TSA tersebut, maka proses sterilisasi dianggap gagal dan proses isolasi yang dilakukan dengan sampel tersebut harus diulang mulai dari awal.
Isolasi bakteri endofit dari jaringan tanaman kentang
Akar, batang, dan daun yang telah disterilisasi masing-masing dipotong kecil-kecil lalu digerus dengan mortar secara terpisah. Hasil gerusan masing- masing diencerkan secara serial dengan akuades steril kemudian disebarkan pada media TSA 20% (TSB 6 g/L, agar-agar 20 g/L), King’s B Agar (KBA) 20%
(proteosa pepton 4 g/L, K2HPO4. 3H2O 0.3 g/L, MgSO4.7H2O 0.3 g/L, gliserol 4 ml/L dan Agar-agar 20 g/L), dan agar Nitrate Mineral Salt (NMS) bebas N (MgSO4.7H2O 1.0 g/L, CaCl2.6H2O 0.2 g/L, KH2PO4 0.272 g/L, Na2HPO4 4.0 g/L, Na2EDTA 0.5 g/L, FeSO4.7H2O 0.2 g/L, H3BO4 0.03 g/L, CoCl2.6H2O 0.02 g/L, ZnSO4.7H2O 0.01 g/L, MnCl2.4H2O 3.0 mg/L, Na2MoO4.2H2O 3.0 mg/L, NiCl2.6H2O 2.0 mg/L dan CaCl2.2H2O 1.0 mg/L, methanol 100 mL/L , dan Bacto Agar 15 g/L). Inkubasi dilakukan pada suhu ruang dan kondisi gelap selama 2 hari sampai 6 minggu. Koloni yang tumbuh pada media isolasi dan menunjukkan morfologi koloni yang berbeda dipilih dan dimurnikan dengan teknik penggoresan kuadran pada media yang sama. Tahapan proses isolasi bakteri endofit secara garis besar ditampilkan pada Gambar 5.
Gambar 5 Diagram alir isolasi bakteri endofit dari tanaman kentang
Penapisan Isolat Bakteri Endofit Kentang Tahap I
Isolat-isolat yang diperoleh ditapis secara bertahap. Tahapan penapisan terdiri dari penapisan awal yang meliputi bioessei Hypersentive Response (HR), uji hemolitik, uji patogenisitas terhadap planlet kentang, dan uji kemampuan menurunkan Disease Insidence (DI) pada kondisi penanaman tidak steril (Gambar 6).
Gambar 6 Diagram alir penapisan isolat bakteri endofit dan kajian perubahan fisiologis inang
Bioesei Hypersentive Response (HR)
Isolat bakteri endofit ditumbuhkan pada media TSA seama 2-7 hari, E. coli
ditumbuhkan pada media Luria Berthani Agar (LBA : yeast extract 5 g/L, trypton 10 g/L, NaCl 10 g/L, dan agar-agar BIOTEK 20 g/L) selama 2 hari, dan Ralstonia solanacearum ditumbuhkan pada media Sucrose Peptone Agar (SPA : sukrosa 20 g/L, Pepton 5 g/L, MgSO4 7H2O 0.5 g/L, KH2PO4 0.25 g/L, dan agar-agar BIOTEK 20 g/L) selama 7 hari. Koloni bakteri yang tumbuh diambil dengan lup inokulasi kemudian disuspensikan dengan garam fisiologis steril sampai diperoleh kepadatan sel ± 107 sel/mL. Sebanyak 0.5-1.0 mL masing-masing suspensi bakteri diinfiltrasikan ke permukaan bawah daun tembakau (Nicotiana tabaccum) umur 2 bulan. Pengamatan terhadap reaksi HR yang timbul di bagian yang diinfeksi dilakukan setiap hari selama 7 hari berturut-turut. Bioesei HR untuk masing-masing isolat dilakukan dalam 5 ulangan.
Uji hemolitik
Uji aktivitas hemolitik dilakukan dengan cara menginokulasikan isolat bakteri ke permukaan media agar darah yang komposisinya terdiri dari : Blood Agar Base (BBL) 40 g/L, dan darah domba steril yang telah di-defibrinasi sebanyak 50 ml/L (Snavely dan Brahier 1960). Setelah diinkubasi selama 1-5 hari pada suhu ruang (29°C-30°C), dilakukan pengamatan ada tidaknya aktivitas hemolitik di sekitar koloni bakteri. Isolat-isolat yang tidak menunjukkan aktivitas hemolitik merupakan isolat terpilih yang digunakan sebagai bahan pada percobaan berikutnya. E. coli K1.1 koleksi IPB Culture Collection (IPBCC) digunakan sebagai kontrol posif pada uji ini. Uji hemolitik untuk setiap isolat dilakukan dalam 3 ulangan.
Uji patogenisitas isolat terhadap planlet kentang
Inokulum bakteri endofit terpilih ditumbuhkan pada medium TSA selama 5- 7 hari. Koloni yang telah tumbuh diambil degan ose selanjutnya disuspensikan dalam akuades steril. Sebanyak 100 µL suspensi bakteri (± 1.0 x107 sel/ mL) diteteskan ke media disekitar akar planlet kentang (Granola) berumur 2 minggu. Sebagai kontrol, akuades steril digunakan untuk menggantikan suspensi bakteri endofit yang diinokulasikan. Planlet yang telah diinokulasi diinkubasi kembali dan gejala penyakit yang ditimbulkan oleh bakteri yang diinokulasikan diamati selama 10 hari. Penumbuhan planlet dilakukan pada kondisi berikut : media Murashige-Skoog, suhu 23ºC, 8 jam gelap dan 16 jam terang (intensitas cahaya 2500 lux). Planlet yang sehat diinkubasi lebih lanjut sampai berumur 4 minggu untuk digunakan sebagai bahan percobaan berikutnya. Uji ini dilakukan masing- masing dalam 3 ulangan (satu planlet dalam satu botol kultur setiap ulangan) untuk setiap isolat.
Uji ketahanan tanaman Generasi 0 (G0) yang diperkaya isolat bakteri endofit terhadap layu bakteri
Plantlet-plantlet yang telah diinokulasi dengan bakteri endofit dan tidak menunjukkan gejala penyakit (sehat) dan telah berumur 4 minggu ditanam dalam
polybag berisi 3 kg media tanam tidak steril yang terdiri atas campuran kompos kotoran ayam, tanah, dan sekam bakar dengan perbandingan 1:1:1. Polybag yang telah ditanami bibit kentang tersebut dipelihara dalam sungkup plastik di Kebun Percobaan BB-BIOGEN Pacet Cianjur, Jawa Barat. Penyiraman dilakukan menggunakan air embung yang terdapat di kebun tersebut. Jumlah planlet yang ditanam masing-masing sebanyak 5 plantlet untuk setiap perlakuan. Pada percobaan ini tidak ada pupuk kimia atau pestisida yang diaplikasikan.
R. solanacearum (Rs) ditumbuhkan pada media SPA selama 5-7 hari pada suhu ruang. Koloni R. solanacearum yang tumbuh diambil menggunakan lup kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Suspensi patogen tersebut (±1x108 sel/mL) digunakan untuk menginokulasi tanaman kentang generasi 0 (G0) yang telah berumur 1.5 bulan. Inokulasi dilakukan dengan cara mengorek tanah berjarak ±3 cm dari pangkal batang sehingga ada 1-2 akar rambut yang terpotong. Selanjutnya sebanyak 5 mL suspensi R. solanacearum disiramkan ke sekitar bagian akar yang terpotong dan rizosfer di sekitarnya. Gejala layu bakteri yang muncul diamati sampai masa panen (12 minggu). Perlakuan endofit yang berhasil
melindungi semua tanaman dalam setiap perlakuan (5 tanaman) dari penyakit layu bakteri diamati parameter pertumbuhannya (biomasa tajuk, biomasa akar, jumlah dan berat umbi).
Pengukuran densitas sel bakteri
Densitas sel bakteri dalam suspensi inokulum ditentukan dengan menggunakan kombinasi teknik spektrofotometri dan plate count (Hadioetomo, 1993). Bakteri yang akan diukur densitasnya ditumbuhkan pada media yang sesuai (TSA untuk bakteri endofit, SPA untuk R. solanacearum). Biomasa sel yang diperoleh dari kultur padat disuspensikan dalam akuades steril atau larutan garam fisiologis kemudian diencerkan secara serial (1:1, 1:2, 1:4, 1:8, dst.). Sebagian suspensi sel dari masing-masing tingkat pengenceran diukur nilai
Optical Density-nya (OD) pada panjang gelombang 600 nm. Sisa suspensi sel dari masing-masing tingkat pengenceran diencerkan lebih lanjut secara serial (10-1, 10- 2
, 10-3 , 10-4 , 10-5 , dst.) kemudian sebanyak 100 µL hasil pengenceran tersebut disebarkan pada cawan agar yang sesuai. Semua agar cawan yang telah diinokulasi diinkubasi pada suhu ruang selama 4-7. Pengukuran densitas sel bakteri pada kultur cair dilakukan dengan cara yang sama tetapi pengenceran dilakukan menggunakan media cair yang sesuai. Jumlah koloni yang tumbuh pada setiap agar cawan dihitung. Nilai jumlah koloni yang tumbuh dari masing-masing tingkat pengenceran dan nilai OD-nya digunakan untuk mendapatkan persamaan kurva konversi nilai OD menjadi densitas sel permililiter.
Penapisan Isolat Bakteri Endofit Kentang Tahap II
Evaluasi ketahanan tanaman G0 yang diperkaya isolat bakteri endofit pada media steril
Seleksi lanjut dilakukan dengan menanam kembali planlet yang sebelumnya telah diinokulasi dengan 2 isolat bakteri endofit terpilih pada 3 kg media tanam seperti yang dilakukan pada tahap seleksi awal namun media tanam dan air yang digunakan untuk menyiram tanaman telah disterilkan terlebih dahulu. Selanjutnya setelah tanaman berumur 1.5 bulan diinfeksi dengan R. solanacearum. Percobaan dilakukan menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) yang terdiri dari 6 perlakuan yaitu tanaman kontrol yang tidak diperkaya endofit dan tidak diinfeksi
R. solanacearum (K), tanaman kontrol yang diinokulasi R. solanacearum (K+Rs),
tanaman diperkaya isolat G053, tanaman diperkaya isolat G062, tanaman diperkaya isolat G053 dan diinokulasi R. solanacearum (G053+Rs), dan tanaman
diperkaya isolat G062 dan diinokulasi R. solanacearum (G062+Rs). Setiap
perlakuan terdiri dari 3 ulangan dan setiap ulangan terdiri dari 8 tanaman. Pengamatan dilakukan terhadap Nilai Disease Incidence (DI) layu bakteri yang dihitung menggunakan persamaan berikut (Kelman 1954):
n = jumlah planlet atau tanaman yang sakit N = jumlah planlet atau tanaman yang diamati
Pengolahan data dilakukan menggunakan program SAS versi 6.12. Nilai DI yang diperoleh dianalisa ragamnya dan apabila ada perbedaan yang nyata dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan pada taraf 0.05.
Evaluasi DI tanaman Generasi 1 (G1) pada media tidak steril.
Evaluasi DI tanaman G1 dilakukan terhadap 3 perlakuan tanaman yaitu tanaman G1Kontrol, G1G053, dan G1G062. Masing-masing perlakuan terdiri dari 15 ulangan, dan setiap ulangan terdiri dari 1 tanaman G1. Umbi yang dihasilkan oleh tanaman G0 kontrol, tanaman diperkaya isolat G053, dan tanaman diperkaya G062 pada percobaan sebelumnya (evaluasi ketahanan tanaman G0 pada kondisi steril) disimpan di dalam lemari pendingin. Umbi yang telah disimpan selama ±3 bulan dan telah bertunas ditanam pada media tanam (komposisi seperti media tanam pada uji ketahanan tanaman pada penapisan awal) yang tidak steril di
screen house di Desa Cipendawa, Cipanas, Cianjur. Tanaman G1 tersebut disiram dengan air yang langsung diambil dari aliran air gunung di kebun. Tanaman G1 tidak diinokulasi secara artifisial, oleh karena itu nilai DI dihitung berdasarkan infeksi yang terjadi secara alami.
Analisis respon fisiologis tumbuhan terkait ketahanan
a. Penentuan kandungan protein total. Masing-masing sebanyak 8
polybag tanaman kontrol (1 tanaman per-polybag), tanaman G053, dan tanaman G062 yang berumur 1.5 bulan dipindahkan dari kebun percobaan BB-BIOGEN di Pacet ke dalam low temperature incubator (23⁰C, 14 jam terang dan 10 jam gelap) di Laboratorium Mikrobiologi, Kelti Biokimia BB-BIOGEN. Setelah tanaman dibiarkan beradaptasi selama 3 hari, dari masing-masing tanaman diambil 200 mg daun muda yang telah berkembang sempurna (daun ketiga dari pucuk). Daun-daun tersebut digerus menggunakan mortar yang telah didinginkan di dalam freezer. Hasil gerusan dihomogenisasi dengan 10 ml buffer fosfat pH 6.8 lalu disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 15 menit pada suhu 4ºC. Supernatan yang merupakan ekstrak daun diambil dan dipindahkan ke dalam botol pyrex bertutup ulir yang telah didinginkan terlebih dahulu. Sebanyak 4 tanaman dari masing-masing perlakuan diinfeksi dengan suspensi R. solanacearum, sedangkan sisanya diperlakukan dengan cara yang sama tetapi dengan akuades (kontrol negatif yang tidak diinfeksi R. solanacearum). Infeksi R. solanacearum dilakukan dengan cara seperti diuraikan di bagian sebelumnya. Dua puluh empat jam dan 48 jam kemudian dilakukan kembali pengambilan sampel daun dari semua tanaman (yang diinfeksi R. solanacearum dan tanaman yang tidak diinfeksi R. solanacearum) untuk diekstraksi seperti diuraikan diatas. Ekstrak daun yang diperoleh ditentukan kandungan protein totalnya menggunakan teknik microassay sebagaimana yang dipublikasikan oleh Bradford (1976). Satu mililiter reagen protein ditambahkan ke dalam tabung berisi 100 µL supernatan atau larutan Bovine Serum Albumin (BSA) yang dipergunakan sebagai standar protein. Campuran reaksi divortex, dibiarkan selama 2 menit, dan akhirnya diukur absorban-nya pada panjang gelombang 565nm. Pengukuran protein dilakukan dalam 4 ulangan.
b. Pengukuran aktivitas enzim peroksidase. Ekstrak daun diencerkan
ditambahkan ke dalam tabung berisi 4 ml campuran reaksi (125 μmol buffer
phosphate pH 6.8, 50 μmol pyrogallol, dan 50 μmol of H2O2), kemudian diinkubasi pada suhu ruang (29-30ºC) selama 5 menit. Reaksi dihentikan dengan cara menambahkan 0.5 ml H2SO4 5% (v/v) (Kar dan Mishra 1976). Campuran reaksi diukur absorbans-nya pada λ: 420 nm. Aktvitas peroksidase diukur dalam 6 ulangan.
c. Pengukuran aktivitas enzim polifenol oksidase. Pengukuran aktivitas
polifenol oksidase dilakukan dengan cara yang sama dengan pengukuran peroksidase, tetapi campuran reaksinya tidak mengandung H2O2 (Kar dan Mishra 1976). Pengukuran polifenol oksidase dilakukan sebanyak 3 ulangan.
d. Pengukuran aktivitas enzim askorbat peroksidase. Aktivitas askorbat
peroksidase ditentukan dengan menggunakan metode Nakano dan Asada (1981). Pengujian aktvitas askorbat peroksidase dilakukan sebanyak 3 ulangan. Sebanyak 200 mg daun muda yang telah berkembang sempurna digerus dalam larutan pengekstrak dingin (2 ml 50 mM bufer fosfat pH 7.0, 1 mL PVP 1%, dan 1 mL 0.2 mM asam askorbat). Hasil gerusan disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm suhu 4°C selama 30 menit. Supernatan yang terbentuk diambil sebanyak 100 µL kemudian dimasukkan ke dalam tabung kuvet yang telah berisi pereaksi (0.5 mL 50 mM bufer fosfat pH 7.0, 1 mL 0.5 mM asam askorbat, 0.2 mL 1 mM EDTA, dan 0.1 mL 0.1 mM H2O2). Campuran reaksi tersebut dihomogenisasi menggunakan pipet kemudian segera diukur absorbansinya pada λ: 290 nm. Pengukuran absorbans dilakukan setiap 10 detik selama 1 menit. Aktivitas enzim askorbat peroksidase dihitung menggunakan persamaan berikut :
� : 289 mM-1 cm-1
e. Pengukuran emisi etilen. Dari 12 tanaman kontrol dan 12 tanaman
G053 masing-masing diambil 1 lembar daun muda yang telah berkembang sempurna. Setiap tiga daun dari perlakuan yang sama digabung, ditimbang, selanjutnya dimasukkan ke dalam 1 tabung reaksi khusus untuk sampel gas dan ditutup rapat. Tabung sampel diinkubasi pada suhu 23⁰±1⁰C selama 16 jam seelum diukur kadar gas etilen yang diemisikannya. Etilen diukur menggunakan kromatografi gas (Hitachi 263-70) dengan detector FID dan kolom Porapack M di Laboratorium tanah, BBSDLP, Cimanggu, Bogor.
Delapan belas jam setelah pengambilan sampel daun yang pertama, setengah jumlah tanaman dari masing-masing perlakuan (6 tanaman kontrol dan 6 tanaman G053) diinfeksi R. solanacearum dengan cara seperti yang telah diuraikan pada bagian sebelumnya (2.4). Sebagai kontrol, rizosfer akar tanaman yang telah dikorek disiram dengan akuades. Setelah 18 jam, kembali dilakukan pengambilan sampel daun untuk diukur emisi etilen-nya. Pengukuran etilen dilakukan dalam 2 ulangan untuk setiap perlakuan (setiap perlakuan terdiri dari 3 daun yang berasal dari 3 tanaman).
f. Penetapan kandungan lignin like compound. Biomasa sampel tanaman
hari, digerus, dan diayak (50 mesh) sebelum dianalisis kadar senyawa serupa lignin-nya menggunakan metode Van Soests et al. (1991). Analisis ini dilakukan di laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan, Departemen Ilmu Pakan dan Nutrisi, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Pengamatan Pertumbuhan Tanaman dan Produktivitas Umbi
Tanaman G0 dan G1 diamati parameter pertumbuhan dan produktivitas umbinya. Parameter pertumbuhan tanaman G0 yang diamati meliputi berat kering tajuk dan berat kering akar, sedangkan produktivitas umbi yang diamati adalah jumlah serta berat umbi per tanaman. Pengukuran berat kering dilakukan setelah sampel tanaman dikeringkan pada suhu 50ºC sampai beratnya stabil (2 hari). Sedangkan parameter pertumbuhan tanaman G1 yang diamati adalah tinggi tanaman, serta jumlah dan berat umbi kentang yang dihasilkan. Tinggi tanaman diukur pada umur 9 minggu setelah tanam (MST), sedangkan jumlah dan berat umbi dihitung setelah panen (12 MST).
Uji Kolonisasi
Pengamatan tampilan morfologi akar planlet yang diperkaya dengan bakteri endofit
Planlet kentang (Granola) umur 2 minggu diinokulasi dengan bakteri endofit dengan cara yang sama seperti diuraikan pada bagian sebelumnya (2.3). Sebagai perlakuan kontrol media disekitar akar planlet ditetesi dengan 100 µL akuades steril untuk pengganti inokulum endofit, sedangkan sebagai pembanding planlet diinokulasi dengan 100 µl suspensi isolat G059 dan G0196. Delapan belas jam setelah inokulasi, kejernihan media tanam dan tampilan akar planlet diamati. Pengamatan dilakukan sampai planlet berumur 4 minggu. Planlet dicabut dengan hati-hati dari media tanamnya pada akhir pengamatan (umur 4 minggu) dan didokumentasikan (difoto) tampilan morfologi bagian luar akarnya.
Pengamatan secara mikroskopis
Planlet dikirim ke divisi Zoologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, di Cibinong Indonesia, untuk diamati kolonisasi bagian dalam batangnya oleh M. endophyticus G053. Spesimen difiksasi menggunakan buffer cacodylate dan glutaraldehida, lalu didehidrasi dengan alkohol bertingkat sebelum dikeringkan menggunakan pengering beku (Goldstein 1992). Spesimen batang yang telah kering dipotong menyerong. Batang disobek dari salah satu ujungnya menggunakan jarum khusus untuk menyingkap bagian dalam batangnya kemudian ditempelkan ke spesimen stub dengan cello-tape ganda, dilapisi dengan emas 400 A◦ menggunakan mesin pelapis Eico I-B2 ion coater dan diamati dengan Scanning Electron Microscope (JEOL, JSM-5310 LV).
Reisolasi bakteri endofit dari tanaman dan planlet
Tanaman dibersihkan dari sisa-sisa media tanam, dicuci menggunakan air mengalir, selanjutnya diseka menggunakan kertas tisu untuk mengeringkan sisa air yang ada di permukaan sampel tanaman. Semua daun dan akar dibuang dengan cara dipotong menggunakan gunting steril. Sampel yang telah dibuang
akarnya direndam berturut-turut dalam 2.5% cairan pemutih komersil (BAYCLIN, Johnson Home Hygiene Product, Indonesia; mengandung 5.25% NaOCl selama) 3 menit, akuades steril, etanol 70% selama 5 menit, dan terakhir dibilas 3 kali dengan akuades steril. Sampel yang telah disterilkan permukaannya dipotong kecil-kecil sebelum digerus dengan mortar steril. Hasil gerusan diencerkan dengan akuades steril, kemudian diinokulasi pada cawan TSA 50%. Planlets dicabut dengan hati-hati menggunakan pinset steril kemudian dipotong pada posisi ± 1.5 cm dari atas bagian planlet yang tertanam dalam media. Potongan planlet ditimbang secara aseptis kemudian langsung digerus, diencerkan secara serial, dan disebarkan di permukaan media TSA 50%. Reisolasi isolat G053 dari planlet dilakukan terhadap planlet umur 6 minggu (4 msi) dan 16 minggu (14 msi). Reisolasi isolat G053 juga dilakukan terhadap planlet umur 6 minggu yang disubkultur dari batang bawah dan batang atas planlet umur 6 minggu (4 msi). Reisolasi isolat G062 hanya dilakukan dari planlet umur 6 minggu (4 msi).
Karakterisasi Isolat Bakteri Endofit Terpilih
Dua isolat terbaik yang memiliki kemampuan tertinggi dalam menurunkan nilai Disease Insidence (DI) penyakit layu bakteri dipilih untuk dikarakterisasi.