BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.7 Metode Mengukur Daya Hambat
Pengujian suatu antibakteri dapat memakai beberapa cara, antara lain metode difusi dan dilusi.
2.7.1.1 Metode Penyebaran (Diffution Method)
Metode ini dilakukan dengan cara menanam bakteri pada lempeng agar yang sesuai, kemudian diletakkan cakram atau silinder yang telah ditetesi dengan bahan uji atau dapat juga bahan uji dimasukkan dalam lubang atau cangkir agar yang telah dibuat pada media. Media yang berisi molekul bakteri dan bahan uji diinkubasi pada suhu 36-37o C selama 12-24 jam. Keampuhan dapat dilihat dengan mengukur diameter zona hambatan pertumbuhan bakteri disekitar cakram, lubang atau cangkir agar. Semakin besar diameter zona hambatan pertumbuhan bakteri menunjukkan bahwa bahan uji dapat menghambat pertumbuhan bakteri dengan baik. Keuntungan metode difusi adalah jumlah sample kecil dan bisa dikerjakan dalam satu petri disk 5-6 sampel sekaligus. Untuk satu jenis mikroorganisme.
2.7.1.2 Metode Pengenceran (Dilution Method)
Metode pengenceran dapat dilakukan dengan pengenceran dalam tabung maupun pengenceran agar. Cara pengenceran dalam tabung dapat dilakukan dengan mengencerkan bahan uji dengan media cair menjadi kelipatan dua secara bertahap sehingga didapatkan beberapa konsentrasi dengan kelipatan setengahnya, sedangkan pada pengenceran agar menggunakan satu seri lempeng agar dengan konsntrasi bahan uji yang berbeda. Selanjutnya diinkubasikan dengan suspensi bakteri dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 36-37o C, kemudian diamati hambatan pertumbuhan bakteri dengan membandingkan kekeruhan atau pertumbuhan dengan control media yang mengandung media konsentrasi. Penghambatan minimal didapatkan dari tabung yang jernih pada pengenceran tertinggi. Metode ini digunakan untuk mengetahui kadar hambatan minimal satu bahan antibakteri, tetapi metode ini hanya sesuai untuk senyawa yang larut dalam air.
2.8 Kerangka Teori
Cengkeh merupakan tanaman rempah yang mempunyai khasiat sebagai penghangat tubuh, stimulan, aromatik, antiseptik, peluruh kentut (karminatif), anestetik lokal, dan obat batuk. Minyak cengkeh dapat digunakan untuk mengatasi sakit gigi.
Bagian tanaman cengkeh yang biasa dimanfaatkan oleh masyarakat adalah bunga, tangkai, dan daun cengkeh. Kandungan kimia bunga, tangkai, dan daun cengkeh adalah saponin, tannin, alkaloid, glikosida, flavonoid, dan minyak atsiri.
Pada penelitian ini digunakan daun cengkeh kering dengan alasan untuk mendapatkan nilai tambah dari dedaunan yang berjatuhan dari pohonnya dan belum dimanfaatkan secara optimal. Kandungan kimia daun cengkeh adalah saponin, tannin, alkaloid, glokosida, dan flavonoid, dan minyak atsiri. Menurut Guenther, daun cengkeh mengandung minyak atsiri sebesar 1-4 %. Minyak daun cengkeh mengandung berbagai komponen yaitu eugenol, asetil eugenol, kariofillin, benzyl, vanillin.
Daun cengkeh kering yang diperoleh dikondisikan selama dua hari dengan cara diangin-anginkan yang bertujuan untuk mengurangi kandungan air dan mendapatkan daun cengkeh yang keringnya itu relative sama antara satu daun dengan daun yang lain.
Penyulingan minyak atsiri dapat digunakan dengan menggunakan beberapa metode destilasi, antara lain destilasi air, destilasi uap dan air, dan destilasi uap.
Distilasi uap ialah tipe khusus atau spesial dari sebuah distilasi (proses pemisahan) untuk suatu bahan yang sensitif terhadap suhu seperti senyawa aromatik yang terdapat didalam minyak atsiri. Distilasi uap ini digunakan sebagai alat untuk mendapatkan suatu senyawa murni dengan hasil yang maksimal dan tingkat kerusakan yang kecil.
Penyulingan dengan uap kering dapat menghasilkan apa yang disebut strong oil / minyak kuat yang kaya akan eugenol. Selain itu kualitas atsiri yang dihasilkan jauh lebih baik.
Penyulingan minyak daun cengkeh dilakukan menggunakan metode destilasi uap dengan lama penyulingan selama 12 jam dan destilat diambil setiap 2
jam. Peneliti mempunyai anggapan dasar bahwa dalam 12 jam, seluruh minyak atsiri telah terdestilasi seluruhnya dan destilat minyak daun cengkeh yang diperoleh pada 2 jam, 4 jam, 6 jam, 8 jam, 10 jam, dan 12 jam mempunyai komponen dan komposisi penyusun yang berbeda, sehingga berpengaruh terhadap aktivitas, kualitas ataupun mutu dari suatu minyak atsiri tersebut.
Destilat yang diperoleh mengandung minyak dan air sehingga perlu dipisahkan. Destilat yang sudah terkumpul diekstraksi 3x dengan ditambahkan 20 ml n-heksan tiap kali ekstraksi. Minyak atsiri akan larut dalam n-heksan karena sifatnya yang sama-sama non polar sedangkan air bersifat polar sehingga tidak larut dalam larutan non polar, sehingga akan lebih mudah untuk memisahkan minyak dengan airnya.
Setelah proses destilasi dilakukan proses evaporasi menggunakan vaccum rotary evaporator yang bertujuan untuk memisahkan minyak atsiri dengan n-heksan. Proses ini dilakukan pada suhu 69 oC, sesuai dengan titik didih n-heksan. Pada saat proses evaporasi, n-heksan akan menguap dan didinginkan di kondensor kemudian mengalir menuju wadah yang disediakan. Proses evaporasi berakhir ketika sudah tidak ada lagi peristiwa kondensasi pada kondensat, dengan kata lain n-heksan telah menguap semua. Untuk memastikan bahwa n-heksan telah menguap sempurna, minyak dialiri gas N2 kemudian ditimbang sampai beratnya konstan sehingga didapatkan minyak daun cengkeh yang murni.
Tiap fraksi minyak daun cengkeh yang diperoleh selanjutnya dilakukan penentuan rendemen, serta komposisi dan komponen penyusunya. Penentuan komponen dan komposisi penyusun minyak daun cengkeh menggunakan metode KG-SM. Analisis dengan KG-SM merupakan metode yang cepat dan akurat
untuk memisahkan campuran dalam sampel, mampu menganalisis cuplikan dalam jumlah yang sangat kecil, dan memperoleh informasi mengenai komposisi dan komponen penyusun destilat minyak daun cengkeh.
Pada proses selanjutnya dilakukan uji aktivitas. Pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas antibakteri karena biayanya yang murah, prosesnya sederhana dan cepat. Salah satu manfaat minyak daun cengkeh adalah sebagai obat sakit gigi. Salah satu bakteri yang mendukung adalah bakteri Streptococcus mutans, sehingga pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri Streptococcus mutans dengan menggunakan metode difusi. Daya antibakteri dapat dilihat dengan mengukur diameter zona hambatan pertumbuhan bakteri disekitar cakram, lubang atau cangkir agar. Semakin besar diameter zona hambatan pertumbuhan bakteri menunjukkan bahwa bahan uji dapat menghambat pertumbuhan bakteri dengan baik. Keuntungan metode difusi adalah jumlah sample yang dibutuhkan sedikit dan bisa dikerjakan dalam satu petri disk 5-6 sampel sekaligus. Pada tahap akhir adalah menganalisis data dan menyimpulkannya.
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN