BAB II. LANDASAN TEORI
A. Tinjauan Pustaka
4. Metode Pemurnian Senyawa
Fraksinasi suatu sampel bahan alam dapat dilakukan dengan metode kromatografi vakum cair (KVC) untuk memisahkan fraksi polar dan non polarnya. Teknik kromatografi vakum cair menggunakan sistem pengisapan (suction) untuk mempercepat proses elusi menggantikan sistem penekanan dengan gas. Kromatografi vakum cair merupakan salah satu kromatografi kolom khusus yang biasanya juga menggunakan silika gel sebagai adsorben. Alat yang digunakan adalah corong buchner atau kolom pendek dengan diameter besar. Pada kromatografi vakum cair, fraksi-fraksi yang ditampung biasanya volumenya lebih banyak dibandingkan dengan fraksi-fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom biasa.
Langkah pemisahan menggunakan kromatografi vakum cair biasanya dilakukan pada tahap awal pemisahan (pemisahan terhadap ekstrak kasar yang diperoleh langsung dari proses ekstraksi). Berbeda halnya dengan kromatografi kolom yang menggunakan tekanan pada bagian atas kolom untuk meningkatkan laju aliran, pada kromatografi vakum cair, bagian atasnya terbuka sehingga untuk mengotak atik kolom atau untuk penggantian pelarut mudah dilakukan. Untuk mempersiapkan kolom pada kromatografi vakum cair perlu diperhatikan jumlah 19
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xxxv
sampel dan diameter kolom seperti yang ditunjukkan pada tabel 1 di bawah ini. Tabel 1. Acuan untuk mempersiapkan kolom pada kromatografi vakum cair
Diameter (cm) Tinggi SiO2 (cm) Berat SiO2 (gram) Sampel (mg) Eluen (ml) 3 4,5 15 15-500 10-15 4 5 30 300-3000 15-30 7 5,5 100 2000-15000 20-30 (Kristanti, 2008) Fraksinasi dengan kromatografi vakum cair ini dilakukan pada penelitian untuk mengisolasi senyawa santon maupun kumarin. Penelitian yang pernah dilakukan seperti isolasi senyawa kumarin dari spesies Calophyllum teysmanii
dengan KVC dimana eluen yang digunakan yaitu n-heksan dengan etil asetat (100% n-heksan-100% etil asetat) (McKee, et. al., 1996). Isolasi senyawa santon dari spesies Calophyllum caledonicum juga dengan KVC dimana eluen yang dipakai yaitu n-heksan dan etil asetat (100% heksan- 40% n-heksan:60% etil asetat) (Morel, et. al., 2002), dari kulit akar spesies Calophyllum inophyllum juga menggunakan KVC dengan eluen n-heksan dan etil asetat dengan perbandingan yang semakin meningkat kepolarannya (Yimdjo, et. al., 2004).
b. Kromatografi Flash
Kromatografi flash merupakan kromatografi dengan tekanan rendah (pada umumnya <20 psi) yang digunakan sebagai kekuatan bagi elusi bahan pelarut melalui suatu ruangan atau kolom yang lebih cepat. Kelebihan kromatografi kolom flash ini dibandingkan kromatografi kolom gravitasi adalah prosesnya memerlukan waktu yang relatif lebih singkat. Pemilihan kolom disesuaikan dengan jumlah cuplikan yang akan dipisahkan. Adsorben yang paling sering digunakan adalah silika gel G60 ukuran 63-200 μm dan silika gel G60 ukuran 40-43 μm (Kristanti dkk, 2008). Pelarut yang digunakan pada umumnya merupakan variasi dua pelarut dimana salah satu pelarut memiliki kepolaran yang lebih tinggi dari pelarut lainnya.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
Isolasi senyawa santon maupun kumarin dari penelitian yang telah dilaporkan menggunakan kromatografi flash ini. Teknik ini digunakan pada isolasi senyawa 1,5-dihidroksisanton (29), calosanton A (23), dan calosanton B (26) dari kulit akar spesies Calophyllum inophyllum (Yimdjo, et. al., 2004) dan isolasi senyawa kumarin dari spesies Calophyllum dispar menggunakan eluen n-heksan dengan etil asetat (Guilet, et. al., 2001).
c. Kromatografi Gravitasi
Kromatografi gravitasi merupakan salah satu jenis dari kromatografi kolom. Kromatografi kolom merupakan suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada peristiwa adsorpsi. Pada kromatografi gravitasi eluen keluar dari kolom berdasarkan adanya gaya gravitasi bumi, tanpa ada pemvakuman atau penekanan. Salah satu kelemahan dari metode ini adalah membutuhkan waktu yang lama.
Gel Sephadex (G) merupakan salah satu adsorben yang digunakan sebagai fasa diam dalam kromatografi kolom. Pada kromatografi ini senyawa dipisahkan berdasarkan berat molekulnya. Jika yang digunakan sebagai eluen adalah air maka senyawa dengan berat molekul lebih besar akan terelusi terlebih dahulu. Jika yang digunakan sebagai eluen adalah pelarut organik maka gel shepadex berperilaku seperti selulosa tetapi kapasitas pemisahannya lebih besar karena ukuran partikelnya lebih teratur. Gel sephadex (LH-20) dirancang untuk digunakan memakai eluen organik. Biasanya yang digunakan adalah metanol. Sebelum digunakan sebaiknya gel sephadex digembungkan terlebih dahulu dalam eluen selama 12 jam (Kristanti dkk, 2008).
Beberapa penelitian isolasi senyawa dari tumbuhan Calophyllum inophyllum juga menggunakan metode kromatografi kolom dengan menggunakan gel sephadex LH-20. Contohnya isolasi calosanton D (27) dari kulit akar tumbuhan ini (Iinuma, et. al., 1995).
d. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan pemisahan komponen kimia berdasarkan prinsip adsorbsi dan partisi, yang ditentukan oleh fase diam (adsorben) dan fase gerak (eluen), komponen kimia bergerak naik mengikuti fase gerak karena daya serap adsorben terhadap komponen-komponen kimia tidak 21
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
xxxvii
sama sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda berdasarkan tingkat kepolarannya, hal inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan (Rohman, 2007).
Fase diam dalam KLT berupa padatan penyerap yang diltakkan pada sebuah plat datar dari gelas atau alumunium sehingga membentuk lapisan tipis dengan ketebalan tertentu. Kebanyakan penyerap yang digunakan adalah silika gel, dimana telah tersedia plat yang siap pakai (Padmawinata, 1991). Salah satu jenis silika gel yang banyak digunakan untuk KLT adalah silika gel 60 GF254. Identifikasi senyawa pada hasil analisis KLT dengan fasa diam 60 GF254 dapat dilkakukan dengan melihat warna noda di bawah sinar UV. Senyawa akan tampak berupa spot gelap (tidak berfluoresence) dengan background yang berpendar saat disinari dengan lampu UV λ254. Identifikasi senyawa juga dapat dilakukan dengan menyemprotkan pereaksi warna yang bersifat universal seperti Ce(SO4)2.
Pelarut sebagai fasa gerak atau eluen merupakan faktor yang menentukan gerakan komponen-komponen dalam campuran. Pemilihan pelarut tergantung pada sifat kelarutan komponen tersebut terhadap pelarut yang digunakan. Kekuatan elusi dari deret-deret pelarut untuk senyawa-senyawa dalam KLT dengan menggunakan silika gel akan turun dengan urutan sebagai berikut : air murni > metanol > etanol > propanol > aseton > etil asetat > kloroform > metil klorida > benzena > toluen > trikloroetilena > tetraklorida > sikloheksana >heksana. Fasa gerak yang bersifat lebih polar digunakan untuk mengelusi senyawa-senyawa yang adsorbsinya kuat, sedangkan fasa gerak yang kurang polar digunakan untk mengelusi senyawa yang adsorbsinya lemah (Sastrohamidjojo, 1991).
Analisis suatu senyawa dalam KLT biasanya dilakukan dengan dibandingkan terhadap senyawa standarnya. Pengamatan yang lazim berdasarkan pada kedudukan noda relatif terhadap batas pelarut yang dikenal sebagai Rf (Retardation factor) yang didefinisikan sebagai berikut :
Rf = Jarak komponen yang bergerak Jarak pelarut yang bergerak
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
Identifikasi senyawa pada kromatogram dapat dilakukan dengan melihat warna noda di bawah sinar UV atau dengan menyemprotkan pereaksi warna sesuai dengan jenis atau kelas senyawa yang dianalisis. KLT digunakan untuk menentukan banyaknya komponen dalam campuran, identifikasi senyawa (uji kemurnian), analisis fraksi-fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, dan menentukan kondisi yang sesuai untuk kromatografi kolom terutama untuk mencari pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom (Rohman, 2007).