BAHAN DAN METODE 3.1. Tempat dan Waktu
3.3. Metode Penelitian
3.3. Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap. Skema tahapan metode dapat dilihat pada Lampiran 1.
3.3.1. Isolasi RNA Total Sengon
Isolasi RNA total dilakukan menggunakan kit dan prosedur yang sama dengan protokol reagen Trizol. Sebanyak 0,1 g jaringan “xylem” batang sengon digerus bersama nitrogen cair hingga halus. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam ependorf tube yang berisi 1 ml reagen Trizol lalu diinkubasi selama 10 menit pada suhu 15-300C. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 40C selama 15 menit. Supernatan diambil dan diekstraksi dengan 200 μl kloroform kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 40C selama 15 menit. Ke dalam supernatan ditambahkan 0,5 ml isopropanol kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm dan suhu 40C selama 15 menit. Pelet dipisahkan dari supernatan lalu dibilas dengan etanol 70% dingin lalu disentrifugasi kembali dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 40C selama 15
menit. Pelet dikeringkan pada suhu ruang , selanjutnya dilarutkan dengan penambahan 20 µl air bebas RNAse (GibcoBRL, 2005).
3.3.2. Sintesis cDNA Gen Sukrosa Sintase Melalui RT PCR
Sintesis cDNA dilakukan dengan metode RT-PCR menggunakan kit ” ready to go RT PCR” dengan prosedur yang sama dengan protokol ready to go RT PCR dari Amersham Biosciences. Sintesis cDNA dilakukan dengan mencampurkan 3 µl RNA total (500 ng) dengan butiran “ ready to go RT PCR “ yang telah dilarutkan dengan 43,9 µl air bebas RNAse, 1,1 µl primer untai pertama pd (T)12-18 konsentrasi 0,5 µg/µl, 1 µl primer maju dengan konsentrasi 100 pmoles, dan 1 µl primer mundur (100 pmoles) dengan volume akhir 50 µl. RT-PCR dilakukan alat PCR Perkin Elmer dengan menginkubasi campuran reaksi pada suhu 420C selama 30 menit dan suhu 950C selama 5 menit (Amersham Bioscience, 2005). PCR cDNA sukrosa sintase dilakukan dengan kondisi predenaturasi 950C 5 menit, denaturasi 950C 0,45 menit, penempelan primer 54,40C 0,45 menit, pemanjangan rantai 720C 1 menit pemanjangan , dan pemanjangan akhir 720C 5 menit. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus (Amersham Biosciences, 2005)
3.3.3. Elektroforesis Produk PCR
DNA hasil amplifikasi dengan PCR dielektroforesis pada gel agarose konsentrasi 1,5% dengan buffer TAE 1x (yang dibuat dari larutan stok TAE 50x dengan komposisi 242 g Tris base; 57,1 ml asam asetat glasial dan 100 ml 0,5 M EDTA pH 8.0) selama 1 jam pada voltase 50 millivolt. Produk elektroforesis selanjutnya direndam dalam EtBr selama 15 menit dan visualisasi pita DNA dilakukan dengan menggunakan foto polaroid diatas lampu UV (Sambrook dan Russel, 2001)
3.3.4. Isolasi dan Pemurnian cDNA Produk PCR
Isolasi dan pemurnian fragmen cDNA produk PCR dilakukan dengan menggunakan kit Sephaglas BrandPrep dengan prosedur yang sama dengan protokol Sephaglas BradPrep. Fragmen DNA sukrosa sintase pada gel agarose
dipotong dengan pisau steril. Potongan gel dicacah untuk mendapatkan potongan-potongan gel yang lebih kecil. 200mg gel agarose dilarutkan dengan 250 µl buffer pelarut gel. Campuran gel agarose kemudian divorteks dan diinkubasi pada suhu 600C selama 5-10 menit hingga gel agarose larut. Fragmen DNA diikat dengan menambahkan 5 µl Sephaglas BP, lalu diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang dan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 30 detik. Pelet fragmen DNA dibilas dengan buffer pencuci. Selanjutnya pelet dilarutkan dengan 30 µl buffer elusi (Amersham Bioscience, 2006).
3.3.5. Kloning cDNA ke dalam Vektor pGemT-Easy
Pengklonan cDNA ke vektor dilakukan dengan cara menginkubasi reaksi ligasi yang terdiri dari campuran 1 µl (50 ng ) vektor pGemT-Easy, 3µl DNA hasil purifikasi (10 ng/µl), 5 µl 2x buffer T4 DNA ligase, 1 µl T4 DNA ligase dan air bebas RNAse dengan volume akhir 10µl pada suhu 40C selama semalam (Promega, 2005)
3.3.6. Transformasi Gen ke E. coli DH5α
Hasil ligasi fragmen cDNA dimasukkan ke kompeten sel E. coli DH5α. Pembuatan kompeten sel bakteri DH5α dilakukan dengan menggunakan kalsium klorida. Satu koloni bakteri E. coli DH5α dikultur dalam 5 ml media LB (10 g/l tripton, 5 g/l yeast ekstrak, 5 g/l NaCl, pH 7.0) selama semalam dalam inkubator shaker pada 370C dengan kecepatan 150 rpm. Selanjutnya 0,5 ml kultur ini dimasukkan dalam 5 ml LB dan diinkubasi pada kondisi yang sama hingga mencapai OD 0,4-0,6. Sebanyak 1 ml kultur ditransfer ke dalam tabung mikro steril dan disentrifugasi pada 5000 rpm, 40C selama 2 menit. Endapan yang diperoleh ditambah dengan 1 ml larutan 0,1 M CaCl2 dingin dan disuspensikan. Suspensi disentrifugasi dengan kondisi yang sama dan selanjutnya endapan disuspensikan kembali dalam 250 µl larutan 0,1 M CaCl2 dingin. Selanjutnya diinkubasi di es selama 10 menit dan bakteri siap untuk ditransformasi. Kompeten sel bakteri sebanyak 250 µl dicampur dengan 10 µl (50-100 ng) DNA hasil ligasi dengan plasmid dan diinkubasi di es selama 30 menit. Campuran tersebut kemudian diberi kejutan panas dengan cara diinkubasi pada suhu 420C
selama 45 detik. Kemudian dimasukkan kembali kedalam es selama 1 jam. Campuran tersebut kemudian diberi kejutan panas kembali pada suhu 420C selama 45 detik lalu dimasukkan ke dalam es. Campuran tersebut kemudian ditambah dengan 2 ml media LB dan diinkubasi pada suhu 370C selama 1 jam. Bakteri disebar pada media seleksi LB yang mengandung 50 mg/l ampisilin, 10 µl 0,1M IPTG dan 50 µl X-gal (20 mg/ml) dan diinkubasi pada suhu 370C selama semalam (Sambrook dan Russel, 2001)
Hanya plasmid yang mengandung pGemT-Easy yang dapat hidup pada media seleksi yang mengandung antibiotik ampisilin. Adanya X-gal dan IPTG akan menghasilkan koloni putih dan biru. Koloni bakteri yang berwarna putih diisolasi karena mengandung pGemT-Easy rekombinan. Bakteri yang mengandung pGemT-Easy rekombinan tidak mampu menghasilkan β -galaktosidase sehingga X-gal tidak dapat diuraikan dan koloni tetap berwarna putih, sedang koloni yang mengandung pGemT-Easy non rekombinan akan berwarna biru karena mampu menguraikan X-gal.
3.3.7. Isolasi DNA Plasmid
DNA plasmid pGemT-Easy rekombinan yang dikloning ke E. coli DH5α
diisolasi menggunakan metode lisis dengan alkali. Satu koloni E. coli DH5α
recombinan dikultur dalam 10 ml media LB yang mengandung 10 µl ampisilin 50µl/ml dan diinkubasi pada inkubator shaker 150 rpm pada suhu 370C selama semalam. Kultur bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 40C selama 2 menit. Endapan bakteri kemudian disuspensikan dalam 100 µl BRS dan 200 µl LS lalu diamkan selama 3 detik. Setelah lisis tambahkan buffer penetralisasi 150 µl koAC dan sentrifugasi pada suhu 40C selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Supernatan diambil dan ditambahkan dengan 250 µl isopropanol, lalu divorteks sampai bercampur dan disentrifugasi kembali pada suhu 40C selama 5 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Kedalam pelet ditambahkan 500 µl aquades dan diberi perlakuan dengan penambahan 0,5 µl RNAse 20 mg/ml selama 2 jam pada suhu 370C untuk menghilangkan sisa RNA. Larutan yang mengandung DNA plasmid diekstraksi dengan campuran fenol dan kloroform dengan perbandingan 24:1 lalu disentrifugasi pada suhu 40C selama 5
menit dengan kecepatan 10000 rpm. Fase atas diambil dan ditambah dengan 2 volume etanol absolut dan dibiarkan pada suhu - 200C selama semalam. Selanjutnya larutan tersebut disentrifugasi pada suhu 40C selama 20 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Pelet dibilas dengan 500 µl etanol 70% dan disentrifugasi kembali pada suhu 40C selama 5 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Pelet dilarutkan dengan penambahan 30 µl H2O (Sambrook dan Russel, 2001)
3.3.8. Sekuensing cDNA
Sekuensing DNA dilakukan dengan menggunakan pereaksi Big Dye terminator dan mesin sekuensing ABI Prisma 3. Komposisi reaksi sekuensing terdiri dari 2 µl BigDye terminator, 1,5 µl DNA cetakan (200 ng), 0,2 µl primer M13-FP (20 pmol/ µl) dan 6,3 µl ddH2O dengan volume total 10 µl. Prinsip kerja BigDye terminator adalah pewarnaan ujung ddNTP yang terdiri dari ddATP, ddTTP, ddCTP dan ddGTP dengan pewarna berpendar yang memiliki panjang gelombang berbeda-beda. Selanjutnya gen sukrosa sintase diamplifikasi menggunakan mesin PCR dengan pereaksi yang salah satu komponennya adalah ddNTP yang telah diberi warna berpendar. Hasil amplifikasi secara langsung dielektroforesis melalui suatu kapiler (capillary electrophoresis) dan urutan basa nukleotida yang teramplifikasi dideteksi melalui suatu ”sequence analyzers”. Output yang diperoleh dari ”sequence analyzers” adalah berupa kromatogram urutan basa nukleotida dengan warna 4 puncak basa nukleotida yang spesifik (Applied Biosystem, 2002).
3.3.9. Analisis Homologi
Berdasarkan hasil pengurutan basa nukleotida gen penyandi sukrosa sintase yang diperoleh dari sengon, maka selanjutnya dilakukan analisis kesamaan dan tingkat homologi dengan sekuen gen sukrosa sintase dari organisme lain yang ada di dalam bank gen NCBI (National Center for Biotechnology Information), http://www. ncbi. nlm. nih.gov/BLAST) dengan prinsip BLAST (Basic Local Alignment Search Tools). Untuk analisis tingkat kesamaan basa nukleotida digunakan program BLASTN (BLAST Nucleotide), sedang untuk analisis tingkat homologi digunakan program BLASTP (BLAST Protein). Analisis tingkat
kekerabatan fragmen sukrosa sintase sengon dengan sukrosa sintase dari organisme lain dapat disajikan dalam bentuk pohon filogenetik. Pohon pilogenetik dibuat dengan cara membandingkan deduksi asam amino gen penyandi sukrosa sintase yang diperoleh dari sengon dan organisme lain yang terdapat pada bank gen dengan program ClustalW (http : //www.ncbi.nlm.nih.gov/ClustalW).