Tahapan percobaan fermentasi untuk produksi etanol dengan melakukan proses daur ulang vinasse sebagai umpan balik dapat dibagi menjadi lima tahapan utama antara lain proses persiapan bahan baku, hidrolisis ubi kayu, fermentasi, persiapan vinasse dan proses daur ulang vinasse.
3.4.1 Persiapan Bahan Baku
Persiapan bahan baku utama penelitian yang berupa ubi kayu diawali dengan membuang bagian pangkal tanaman yang masih melekat dengan umbi karena umbi yang dipakai dalam penelitian ini dibeli dari petani dalam keadaan masih melekat utuh dengan batang bawah untuk menjaga kesegaran umbi ketika dibawa dari tempat panen ke laboratorium. Ubi kayu kemudian diproses lebih lanjut di Laboratorium SBRC IPB Baranangsiang untuk membersihkan kotoran dan tanah yang masih menempel di umbi dengan cara pencucian. Umbi ubi kayu yang telah bersih kemudian dikupas lapisan kulit arinya yang berwarna cokelat menggunakan pisau. Proses pengupasan selain untuk membersihkan kulit ari sekaligus juga berfungsi untuk menyortir umbi yang jelek, membuang bagian pangkal umbi yang mengandung kayu dan bagian akar yang masih menempel di umbi. Ubi kayu yang telah bersih kemudian dicuci dengan air untuk menghilangkan tanah dan kotoran yang masih menempel pada umbi.
Ubi kayu yang telah bersih kemudian digiling hingga halus menggunakan mesin parut hingga menjadi bubur. Bubur ubi kayu kemudian dikarakterisasi sifat kimia antara lain komponen proksimat (air, abu, lemak, protein, serat kasar dan karbohidrat (by difference) menurut metode AOAC (1995)), pati dan komponen serat (ADF, NDF, selulosa dan lignin menurut metode Van Soest (1963)). Prosedur analisis secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 1.
3.4.2 Hidrolisis Asam
Metode hidrolisis yang digunakan merupakan hasil modifikasi metode hidrolisis yang dipergunakan oleh Susmiati (2010). Hasil hidrolisis tepung ubi kayu dengan total padatan substrat 30% dengan konsentrasi H2SO4 0,4 M akan
menjadi patokan bagi hasil hidrolisis bubur ubi kayu. Bubur ubi kayu dihidrolisis menggunakan larutan H4SO4 0,4 M dengan total padatan substrat 30%, 35%,
20%, 18% dan 15%. Hasil hidrolisat kemudian diamati tingkat kesempurnaan proses hidrolisis berdasarkan warna hidrolisat yang merata dan tidak adanya gumpalan ubi kayu. Hasil hidrolisis bubur ubi kayu dengan total padatan substrat 18% dipilih karena menghasilkan total padatan terlarut hidrolisat tertinggi dan tidak adanya gumpalan ubi kayu yang di dalam hidrolisat. Bubur ubi kayu dengan
total padatan substrat 18% kemudian dihidrolisis dengan konsentrasi H2SO4 0,4 M
dan 1 M yang kemudian diukur nilai total padatan terlarut hidrolisatnya. Nilai total padatan terlarut hidrolisat yang didapatkan kemudian dibandingkan dengan nilai total padatan terlarut hidrolisat hasil hidrolisis tepung ubi kayu. Nilai hasil total padatan terlarut hidrolisat yang mendekati nilai total padatan terlarut tepung ubi kayu yang akan digunakan di dalam penelitian ini, yaitu kadar padatan bubur ubi kayu 18% dengan konsentrasi H2SO4 1 M.
Hidrolisis asam dalam penelitian ini dilakukan dalam satu tahap menggunakan otoklaf sederhana dimana suhu dan waktu hidrolisis diatur secara manual. Waktu hidrolisis dihitung ketika kondisi suhu telah tercapai. Bubur ubi kayu dihidrolisis dengan volume total 500 ml dalam erlenmeyer 1000 ml yang diberi sumbat kapas dan alumunium foil untuk mencegah larutan meluap keluar ketika dilakukan proses hidrolisis. Hidrolisis dilakukan dengan menambahkan asam H2SO4 pekat teknis sebanyak 23 ml ke dalam 270,68 g bubur ubi kayu dan
ditambahkan aquadest sebanyak 206,32 ml. Perbandingan yang dipakai tersebut untuk mencapai kondisi proses hidrolisis yang diinginkan yaitu kadar padatan 18% dan konsentrasi H2SO4 sebesar 1 M. Campuran kemudian dihidrolisis
menggunakan otoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit sehingga diperoleh hidrolisat asam yang berwarna merah tua. Proses hidrolisis ini ditujukan untuk memecah komponen pati dan serat yang ada di dalam bahan menjadi glukosa. Selanjutnya dilakukan pengukuran total gula dan gula pereduksi untuk melihat tingkat hidrolisis.
3.4.3 Fermentasi Etanol A. Persiapan Media Fermentasi
Hidrolisat asam sebelum digunakan sebagai media fermentasi harus melalui proses netralisasi, penyaringan dan sentrifugasi. Proses netralisasi hidrolisat menggunakan NH4OH teknis 21% hingga pH 4,5. Tahap persiapan hidrolisat
selanjutnya adalah proses pemisahan padatan dengan cairan hidrolisat yang terdiri dari dua tahapan proses yaitu penyaringan dan sentrifugasi. Proses penyaringan dilakukan menggunakan kain saring yang berfungsi untuk memisahkan ampas yang berukuran besar. Ampas yang didapatkan dilakukan karakterisasi yang
meliputi analisis kadar air, kadar abu, total N, kadar lemak, kadar serat, kadar karbohidrat. Prosedur analisis secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 1.
Hasil penyaringan dilanjutkan dengan proses sentrifugasi untuk mengurangi jumlah padatan terlarut dan kelebihan garam yang terbentuk dari proses netralisasi. Proses sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 2500 rpm selama 5 menit sehingga dihasilkan dua produk yaitu sludge dan filtrat. Filtrat digunakan sebagai media fermentasi etanol sedangkan sludge tidak digunakan.
B. Fermentasi Etanol
Fermentasi dilakukan dengan menambahkan S. cerevisiae sebagai agen yang melakukan fermentasi dalam bentuk dry baker yeast komersial (ragi roti) dan sumber nutrisi berupa pupuk NPK. Jumlah ragi roti dan NPK yang ditambahkan sebanyak 0,06% total gula dan ragi roti sebanyak 0,23% total gula. Proses fermentasi dilakukan selama 96 jam pada suhu ruangan dengan 24 jam pertama diberi perlakuan agitasi menggunakan orbital shaker (129 rpm) dengan sistem tertutup. Hasil fermentasi yang didapatkan dilakukan analisis mengenai kadar etanol, kadar gula, pH dan total asam. Prosedur analisis dapat dilihat secara lengkap pada Lampiran 1. Proses fermentasi diakhiri setelah 96 jam dan dilanjutkan dengan proses destilasi.
Kaldu hasil fermentasi kemudian didestilasi untuk memisahkan produk utama yang berupa etanol dan cairan sisa destilasi sebagai produk samping akhir proses destilasi. Parameter yang diamati pada akhir fermentasi antara lain efisiensi pembentukan produk, efisiensi fermentasi dan efisiensi penggunaan substrat. Hasil dari destilasi yang berupa cairan berwarna cokelat gelap inilah yang menjadi bahan baku utama yang diteliti dalam penelitian ini. Cairan hasil destilasi ini kemudian disebut dengan istilah vinasse.
3.4.4 Persiapan Vinasse
Vinasse sebelum digunakan sebagai umpan balik dilakukan karakterisasi sifat kimia yang meliputi meliputi analisis pH, total gula, total gula pereduksi, total padatan terlarut, total asam, kadar HMF, BOD5 dan COD. Prosedur analisis
secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 1. Vinasse yang didapatkan dari hasil destilasi mempunyai nilai pH yang rendah.
Vinasse harus diolah terlebih dahulu agar dapat dipergunakan kembali sebagai bahan fermentasi alkohol, yaitu dengan melakukan proses netralisasi dan sentrifugasi. Hasil karakterisasi vinasse menjadi acuan dalam melakukan proses pengolahan pretreatment sebelum dilakukan daur ulang. Vinasse dinetralkan dahulu menggunakan NH4OH 21% hingga mencapai pH 4,5 untuk menyesuaikan
dengan kondisi pH yang digunakan dalam proses fermentasi. Vinasse kemudian disentrifugasi pada kecepatan 2500 rpm selama 5 menit untuk memisahkan sludge dengan filtrat (treated vinasse). Diagram alir pengolahan vinasse menjadi hidrolisat yang siap digunakan sebagai media fermentasi secara lengkap dapat dilihat pada Gambar 6.
Penyaringan Netralisasi pH 4,5 Sentrifugasi 2500 rpm, 5 menit Vinasse Padatan NH4OH 21% Treated Vinasse
Gambar 6 Diagram alir proses pengolahan vinasse. 3.4.5 Daur Ulang Vinasse
Modifikasi yang dilakukan dalam penelitian ini adalah dengan melakukan pengolahan kembali produk samping yang keluar dan menggunakan kembali sebagai media fermentasi baru. Produk samping yang keluar, baik produk samping padat maupun vinasse, masih banyak mengandung kandungan karbohidrat yang dapat digunakan sebagai media fermentasi. Produk samping yang ada akan diproses untuk mendapatkan komponen gula sederhana sebagai bahan baku pembuatan etanol. Hasil pengolahan vinasse akan dikombinasikan dengan hidrolisat baru sehingga menjadi media fermentasi baru. Diagram alir proses daur ulang vinasse dapat dilihat secara lengkap pada Gambar 7.
Vinasse diformulasikan dengan jumlah 60% (V1), 50% (V2) dan 40% (V3) sedangkan sisanya adalah hidrolisat ubi kayu segar untuk mencari komposisi yang dapat menghasilkan kadar etanol terbaik. Hasil formulasi diatur total padatan terlarutnya hingga mencapai 15% (obrix). Media fermentasi sebelum difermentasi dilakukan proses sterilisasi selama 5 menit pada suhu 105oC untuk mematikan mikrob lain yang dapat mengganggu pertumbuhan S. cerevisiae kemudian ditambahkan NPK sebanyak 0,06% total gula dan khamir sebanyak 0,23% total gula. Proses fermentasi selama 24 jam pertama dilakukan di atas shaker dengan kecepatan 129 rpm dan setelah 24 jam, fermentasi dilanjutkan tanpa pengadukan. Kaldu hasil fermentasi dianalisis kadar etanol, kadar gula dan pH dimana prosedur analisis secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 1. Proses fermentasi dengan melakukan daur ulang vinasse dilakukan berulang hingga tiga kali tingkatan (T1, T2 dan T3). T0 adalah fermentasi awal menggunakan hidrolisat ubi kayu tanpa penambahan vinasse. Media Fermentasi Fermentasi Destilasi Persiapan Vinasse Etanol Vinasse
Treated Vinasse Hidrolisat
Gambar 7 Diagram alir proses daur ulang vinasse.