Tempat dan Waktu
Penelitian dilakukan di Laboratorium Bioteknologi SEAMEO-BIOTROP, Bogor. Waktu pelaksanaan mulai bulan September 2010 hingga Oktober 2011.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan adalah daun pohon sengon (Paraserianthes falcataria). Selain itu digunakan juga bahan-bahan untuk isolasi DNA, pereaksi PCR, elektroforesis, ekstraksi gel, ligasi dan transformasi. Alat yang digunakan adalah pipet mikro, gelas ukur, mortar dan pestel, timbangan analitik, waterbath, Maxi Mix Vortex Thermolyne, mikrosentrifuse (microfuge 200R Hettich), vacum dryer, Gene Amp PCR System 9700, alat elektroforesis (Owl Separation System 800-5560), hotplate, DU 530 UV-VIS spektrofotometer, laminar air flow, shaker inkubator, kodak geldoc.
Prosedur Pelaksanaan Penelitian Pengambilan Sampel
Sampel berasal dari hutan tanaman Perum Perhutani BKPH Pare, KPH Kediri. Sampel berupa daun pohon sengon provenan Kediri. Sampel dimasukkan ke dalam plastik klips yang berisi silika gel.
Isolasi DNA Genomik Sengon
Metode 1
Isolasi DNA genomik sengon dilakukan dengan metode Orozco-Castillo et al. (1994). Sampel daun sengon sebanyak 0.27–0.3 g digerus dalam nitrogen cair hingga sampel berbentuk bubuk. Bubuk sampel langsung dimasukkan dalam tube yang berisi 1 mL bufer ekstrak CTAB dan 10 µL merkaptoetanol. Larutan berisi bubuk sampel divortex dan diinkubasi pada suhu 65 oC dalam waterbath selama 45 menit. Campuran ditambahkan 750 µL fenol:kloroform:isoamilalkohol (25:24:1) dan kemudian disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil dan ditambahkan 1x volume kloroform isoamilalkohol lalu disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 menit. Tahapan ini dilakukan sebanyak
2 kali. Supernatan diambil dan ditambahkan 1x volume isopropanol dingin. Larutan dihomogenkan perlahan hingga berbentuk benang putih kemudian diinkubasi pada suhu -20 oC selama semalam. Larutan kemudian disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 menit. Hasil sentrifugasi berupa pelet DNA, pelet DNA kemudian dibilas dengan alkohol 70%. Pelet divakum hingga tidak tercium aroma alkohol dan kemudian dilarutkan dengan 200 µL bufer TE.
Metode 2
Isolasi DNA genomik dilakukan menggunakan GenElute plant Genomic DNA Miniprep Kit. Berat sampel yang digunakan adalah 100 mg bubuk daun sengon yang telah digerus dengan penambahan nitrogen cair. Prosedur isolasi DNA mengikuti prosedur kit. DNA dilarutkan dengan larutan elusi sebanyak 100 µL. Metode 3
Isolasi DNA genomik dilakukan dengan menggunakan bufer CTAB (metoda 1) yang dimodifikasi dengan penggunaan GenElute plant Genomic DNA Miniprep Kit. Isolasi DNA sengon dilakukan dengan menggerus daun pohon sengon sebanyak 0.27 – 0.3 g. Daun digerus dengan menambahkan nitrogen cair hingga berbentuk bubuk halus. Bubuk hasil gerusan dimasukan ke dalam tube 2 mL yang berisi buffer ekstrak (1 mL bufer CTAB dan 10 µL mercaptaetanol). Campuran dalam tube tersebut divortex dan kemudian diinkubasi dalam waterbath selama 45 menit pada suhu 65 oC. Setiap 15 menit sekali tabung- tabung tersebut diangkat dari waterbath dan dikocok. Setelah inkubasi, tube diangkat dan didinginkan pada suhu ruang selama 15 menit untuk selanjutnya dilakukan pemurnian DNA. Pemurnian DNA dilakukan dengan menambahkan fenol kloroform isoamilalkohol (25:24:1) sebanyak 750 µL, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Tahapan ini dilakukan sebanyak dua kali. Supernatan hasil sentrifugasi dipindahkan ke tube baru dan ditambahkan kloroform isoamilalkohol (24:1) dan disentrifugasi. Tahapan selanjutnya adalah binding dengan menggunakan GenElute plant Genomic DNA Miniprep Kit. Sebanyak 500 µL supernatan ditambahkan 700 µL larutan binding kemudian dihomogenkan dengan membolak-balik tube. Campuran dipipet ke tube berisi gen elute miniprep binding coloum yang sebelumnya telah diaktifkan membrannya dengan larutan preparation coloum. Campuran didiamkan dalam
colom selama 5 menit kemudian disentrifugasi pada 12000 rpm selama 1 menit. Binding coloum ditempatkan pada tube baru kemudian dicuci dengan menambahkan 500 µL larutan pencuci (wash solution) yang telah diencerkan lalu disentrifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit untuk mengeringkan etanol. Setelah pencucian, binding coloum ditempatkan pada tube baru, kemudian dilakukan pelarutan DNA yang terbinding dengan menambahkan dalam keadaan hangat 100 µL larutan elution ke dalam coloum. Larutan elusi dalam coloum didiamkan selama 5 menit dan disentrifugasi pada 12000 rpm selama 1 menit. Pelarutan dilakukan dua kali dengan cara yang sama sehingga diperoleh 200 µL larutan stok DNA.
Hasil isolasi DNA dilakukan uji kualitas dan kuantitasnya. Kualitas DNA diketahui dari hasil elektroforesis menggunakan agarose 1%. DNA sebanyak 5 µL dicampur dengan 1 µL loading buffer, kemudian dimasukkan dalam sumur elektroforesis. Kemurnian DNA diukur dengan nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Nilai panjang gelombang 260 nm digunakan untuk pengukuran kuantitas DNA dengan rumus (Muladno 2010), yaitu Konsentrasi DNA = A260nm x faktor pengenceran x 50µg/µ L.
Perancangan Primer
Primer untuk gen TI dan AAI dirancang dengan menggunakan program komputer. Tahap awal dilakukan dengan mencari sekuen gen TI dan AAI rujukan dari situs NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Sekuen yang dipilih adalah sekuen gen dari tanaman leguminoceae. Sekuen tersebut kemudian dimasukkan dalam program primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3) untuk menghasilkan sekuen primer yang hendak digunakan dalam pengujian. Primer yang dipilih adalah primer yang memiliki kandungan GC 50% (Dieffenbach et al.1993).
Amplifikasi DNA Genomik dengan PCR
Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan 2 macam primer, yaitu primer hasil desain menggunakan program primer3 (Tabel 1) maupun primer spesifik terhadap gen AAI dan TI yang sudah dipublikasikan (Tabel 2).
Tabel 1 Sekuen primer gen AAI dan TI hasil desain menggunakan program primer3
Primer Sekuen Nukleotida AAI (forward) AAI (reverse) TI (forward) TI (reverse) CTTCTCTCCCACGCAAACTC TGAAGTTGGTGTCGAAGCTG CCATGGATCTGAACCACCTC CCTGGACTTGCAAGGTTTGT
Tabel 2 Sekuen primer gen AAI dan TI yang sudah dipublikasikan
Primer Sekuen Primer Sumber
α-AI1 Tripsin Inhibitor Forward : 5’-GCCTTGGGATGTACACGACT-3’ Reverse : 5’-CTCCATTGATAAGCCCCTGA-3’ Astart : 5’-TCNGAYGCNGARAARGTNTAYGA YATHGA-3’ Astop: 5’-NGAYTCNGTYTCNGANCCNGANCG NGGYTT-3’ Barbosa et al. 2010 Hung et al. 2007
Volume reaksi PCR yang digunakan adalah 25 µL yang mengandung 250 ng DNA, pasangan primer (forward dan reverse) masing-masing 0.8 µM, 1X bufer KOD Hot Start DNA Polymerase, MgSO4 1.5 mM, dNTPs 0.2 mM
(masing-masing), enzim KOD Hot Start DNA Polymerase 1 U serta water nuclease. Program PCR yang digunakan adalah Pre-denaturasi 95 oC selama 2 menit, dilanjutkan dengan 35 siklus denaturasi pada suhu 95 oC selama 20 detik, annealing pada suhu tertentu selama 10 detik, dan ekstensi selama 10 detik pada suhu 70 oC. Produk PCR selanjutnya dielektroforesis. Gel yang digunakan adalah gel agarose 1.5%. Pembuatan gel agarose dilakukan dengan cara melarutkan 0.6 g agarose dalam 40 mL bufer TAE 1X. Elektroforesis dilakukan dengan mengambil 5 µL PCR produk yang dicampur dengan 1 µL loading buffer. Gel hasil elektroforesis kemudian divisualisasikan di dalam geldoc untuk melihat fragmen DNA yang terbentuk, kemudian difoto untuk dokumentasi. Kegiatan PCR dan elektroforesis ini dilakukan dengan cara yang sama, baik menggunakan primer spesifik terhadap tripsin inhibitor maupun alfa amilase inhibitor.
Ektraksi DNA Hasil PCR dari Gel Agarose
Hasil amplifikasi gen dengan PCR dimurnikan dengan mengekstraksi pita- pita yang terbentuk pada gel hasil elektroforesis. Gel yang mengandung gen target dipotong menggunakan scalpel steril. Ekstraksi gel dilakukan dengan menggunakan prosedur Kit QiaquickR Spin (Qiagen) dengan metode mikrosentrifuse. Gel dipotong pada daerah yang ada band dengan berat < 400 mg. DNA dielusi dengan penambahan 30 µL bufer EB (10 mM Tris-Cl).
Kloning Fragmen DNA Produk PCR
1. Ligasi Fragmen DNA pada vektor kloning.
Vektor kloning yang digunakan adalah pGEM-T Easy. Volume reaksi ligasi sebanyak 10 µL yang terdiri dari 2x buffer ligasi 5 µL, vektor pGEM-T Easy 0.5 µL, DNA hasil elusi produk PCR 3.5 µL, dan T4 DNA ligase 1 µL. Campuran reaksi diinkubasi pada suhu 4 oC selama semalam.
2. Pembuatan Sel Kompeten Escherichia coli
Bakteri E.coli XL1-blue dibuat sel kompeten. E.coli dikulturkan dalam media agar LB yang mengandung tetrasiklin 100 ppm dan diinkubasi semalam pada suhu 37 oC sehingga terbentuk koloni. Koloni bakteri dikulturkan ke dalam media cair LB yang mengandung tetrasiklin 100 ppm pada suhu 37 oC selama semalam. Larutan kultur diambil sebanyak 1 mL dan ditambahkan 100 ppm tetrasiklin dan 3 mL media LB. Larutan diinkubasi dalam shaker 200 rpm pada suhu 37 oC selama 3 jam. Hasil inokulasi dimasukkan ke dalam tabung mikro steril. Hasil kultur diambil sebanyak 1.5 mL dan didiamkan dalam es selama 5–10 menit. Larutan disentrifugasi pada 6000 rpm dan suhu 4 oC selama 2 menit. Supernatan dibuang dan pelet disuspensi dengan 1 mL CaCl2 0.1M dingin. Larutan diinkubasi dalam es
selama 15 menit kemudian disentrifugasi pada 6000 rpm dan suhu 4 oC selama 2 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang sedangkan pelet disuspensi dengan 200 µL CaCl2 0.1 M dingin. Tabung mikro yang berisi sel
kompeten dimasukkan ke dalam nitrogen cair kemudian disimpan pada suhu -80oC.
3. Transformasi dan Seleksi Plasmid Rekombinan
Plasmid hasil ligasi fragmen DNA sebanyak 5 µL ditambahkan ke dalam sel kompeten E.coli sebanyak 200 µL. Campuran didiamkan dalam es selama 30 menit kemudian diberi kejut panas (heat shock) pada suhu 42 oC dalam waterbath selama 50 detik dan segera didinginkan dalam es selama 10 menit. Media LB dan glukosa 20 mM sebanyak 800 µ L ditambahkan ke dalam campuran kemudian diinkubasi dalam shaker inkubator pada suhu 37
o
C dan 200 rpm selama 1 jam 30 menit. Campuran larutan tersebut kemudian disentrifugasi pada 3500 rpm selama 5 menit. Pelet yang terbentuk dilarutkan dengan 100 µL supernatan hingga pelet larut sempurna. Larutan tersebut kemudian disebarkan di atas permukaan media seleksi berupa media LA yang mengandung ampisilin 100 ppm, X-Gal 40 ppm, IPTG 0.1 mM dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama semalam. Koloni bakteri transforman yang berwarna putih kemudian di PCR untuk seleksi plasmid rekombinan.
PCR koloni dilakukan dengan menggunakan pasangan primer M13 forward dan reverse. Volume reaksi PCR yang digunakan adalah 15 µL yang mengandung 10 µL larutan bakteri (koloni bakteri dilarutkan dalam 10 µL water nuclease), pasangan primer M13 (forward dan reverse) 10 µM masing- masing 0.15 µL, 10x bufer komplete (Fermentas) 1.5 µL , 10 mM dNTPs 0.3 µL, enzim tag DNA Polymerase 0.15 µL serta water nuclease 2.75 µL. Program PCR yang digunakan adalah program PCR koloni. Tahap pertama terdiri dari 1 siklus program lisis bakteri (96 oC selama 5 menit dilanjutkan dengan 50 oC selama 90 detik, 96 oC selama 90 detik, 45 oC selama 90 detik, 96 oC selama 1 menit dan 40 oC selama 1 menit. Tahap kedua adalah PCR, dimana larutan bakteri dicampurkan dengan campuran reaksi PCR. Reaksi PCR terdiri dari 30 siklus (94 oC selama 30 detik, 55 oC selama 1 menit dan 72 oC selama 2 menit) dilanjutkan dengan 1 siklus 72 oC selama 5 menit. Seleksi plasmid rekombinan dilakukan berdasarkan elektroforesis hasil PCR pada agarosa 1%. Koloni bakteri rekombinan dipilih yaitu yang menghasilkan amplikon dengan kualitas yang bagus dan ukuran spesifik yang sesuai dengan hasil ekstraksi gel.
Isolasi DNA Plasmid Rekombinan
Isolasi DNA plasmid rekombinan diambil dari koloni hasil transformasi yang telah diseleksi berdasarkan PCR koloni. Koloni bakteri diambil dengan menggunakan tusuk gigi steril dan dicelupkan dalam 10 mL media LB yang mengandung ampisilin 100 ppm. Larutan diinkubasi selama semalam dalam shaker inkubator pada suhu 37 oC. Larutan hasil kultur sebanyak 8 mL digunakan untuk isolasi plasmid sedangkan 2 mL disimpan dalam gliserol sebagai stok. Penyimpanan dilakukan pada suhu -70 oC. Isolasi plasmid dilakukan menggunakan prosedur PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit (Invitrogen). Hasil isolasi dielusi dengan 50 µL bufer TE.
Sekuensing dan Analisis Homologi
Sekuensing fragmen DNA genomik sengon terklon dilakukan oleh PT.Gentika Science di Singapura. Materi yang disekuen adalah DNA plasmid rekombinan. Sekuen DNA hasil sekuensing dianalisis homologi dengan menggunakan program BLAST pada situs NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Program BLASTN membandingkan sekuen nukleotida hasil sekuensing dengan sekuen nukleotida yang ada pada database. BLASTX membandingkan sekuen nukleotida dengan sekuen protein database. Analisis homologi menggunakan program ini untuk memastikan sekuen tersebut merupakan sekuen gen target.