METODE PENELITIAN 3.1. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Gen, Balai Pengkajian Bioteknologi-BPPT Serpong, Tangerang, dari bulan Maret 2013 hingga bulan Januari 2014.
3.2. Alat dan Bahan 3.2.1. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pisau steril [Vidrex], pipet mikro 0,1-2µL, 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL [Nichipet EX], tips 10 µL, 100 µL, 1000 µL, tabung sentrifugasi 1,5 m, tabung mikrosentrifugasi 200 µl [Axygen], rak tabung, mesin micro sentrifuge [TOMY MX-301], timbangan analitik [ADAM®], ice maker [HOSHIZAKI], vortex [Heidolph], magnetic
stirrer, inkubator [Memmert], spatula, kulkas [Toshiba], autoclave, freezer -20oC
[Angelantoni Scientifica], lemari pendingin 4oC [Iberma], microwave [National], satu set elektroforesis [Mupid® -2Plus], gel documentation, Spektrofotometer Nano Drop [ND-1000], dan Insulated Isothermal PCR. Alat gelas yang digunakan adalah gelas ukur 100 ml, Labu Erlenmeyer 250 ml, gelas Beaker [Pyrex], kaca arloji, dan batang pengaduk.
3.2.2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging babi segar dan daging sapi segar yang didapatkan dari pasar swalayan di Lebak Bulus. Bahan lain seperti cell lysis buffer (Tris-EDTA pH 8 dan SDS 1% v/v), proteinase K, RNAse A, NaCl 5M, fenol, kloroform, isoamilalkohol, etanol 70%, etanol absolut, Na asetat, agarosa, buffer TAE, loading dye 6x , Sybr Safe, free nuclease water, Go Taq Green Master Mix®, primer babi, primer sapi, probe babi, probe sapi, dNTP, KAPPA 2G Robust, buffer ii-PCR.
22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.3. Tahapan Penelitian
1. Pengumpulan sampel daging babi dan daging sapi. 2. Isolasi DNA daging babi dan DNA daging sapi.
3. Cek keberadaan DNA babi dan DNA sapi dengan elektroforesis. 4. Optimasi suhu annealing primer dengan PCR konvensional. 5. Uji spesifitas dan sensitivitas primer dengan PCR konvensional.
6. Optimasi komposisi ii-PCR untuk amplifikasi DNA babi dan DNA sapi.
3.4. Prosedur Kerja
3.4.1. Isolasi dan Purifikasi DNA pada Daging Sapi dan Daging Babi.
Proses isolasi DNA pada daging sapi dan daging babi adalah sebagai berikut: ditimbang sebanyak 500 mg daging yang telah dihaluskan, kemudian dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi 1,5 ml, ditambahkan 750 µl cell lysis
buffer (Tris-EDTA pH 8 dan SDS 1% v/v) dan ditambahkan 3µL proteinase K
lalu dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 55oC overnight (16 jam). Setelah diinkubasi, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm, selama 10 menit. Setelah itu supernatan yang terbentuk dipisahkan dan ditambahkan 20 µl NaCl 5 M dan 5 µL RNAse, lalu diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk dipisahkan lalu ditambahkan fenol-kloroform (1:1)
equal volume, kemudian dihomogenkan dan disentrifugasi dengan kecepatan
14000 rpm selama 10 menit. Kemudian lapisan atas yang terbentuk dipisahkan lalu ditambahkan kloroform-isoamilalkohol (24:1) equal volume, kemudian dihomogenkan dan disentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm selama 10 menit. Setelah itu lapisan atas dipisahkan dan ditambhakan etanol absolute 2x volume dan Na asetat 3 M pH 7 1/10 volume, kemudian dihomogenkan dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu -20oC. Setelah diinkubasi, campuran disentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm dengan suhu 4oC selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang sedangkan pelet ditambahkan dengan 500 µl etanol 70%, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang, DNA dikeringkan dengan pompa vakum selama 10 menit kemudian ditambahkan buffer TE 100 µl. Keberadaan DNA dicek dengan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
menggunakan metode elektroforesis, sedangkan konsentrasi dan kemurnian DNA dicek dengan menggunakan spektrofotometri Nano Drop 1000. DNA yang telah dilarutkan disimpan pada suhu -20oC (Kesmen et al., 2009).
3.4.2. Elektroforesis
Gel agarosa 1% digunakan untuk elektroforesis DNA genom dan hasil produk PCR. Untuk pembuatan gel agarosa 1%, ditimbang sebanyak 0,3 gr atau 0,6 gr agarosa dan kemudian dilarutkan dengan 30 mL atau dengan 60 mL TAE 1x, lalu dipanaskan di dalam microwave selama 1 menit sampai agarosa menjadi larut dan larutan berwarna bening. Selanjutnya larutan agarosa didinginkan hingga suhu 40oC, kemudian ditambahkan 0,6 µL atau dengan 1,2 µL sybr safe dan dihomogenkan, lalu dituang ke dalam gel caster yang telah disisipkan comb. Selanjutnya agarosa didiamkan hingga membentuk gel padat.
Setelah terbentuk gel padat, gel diletakkan pada chamber elektroforesis dengan posisi sumur pada muatan negatif. Kemudian buffer TAE 1x dituang hingga gel terendam dalam chamber elektroforesis namun tidak melebihi garis batas maksimum.
Pencampuran sampel yang akan dielektroforesis dilakukan dengan menggunakan parafilm. DNA sampel yang digunakan sebanyak 5 µL dan ditambah 1 µL Loading dye. Kemudian marker DNA diletakkan di sumur paling kiri, diikuti selanjutnya DNA sampel.
Chamber elektroforesis ditutup rapat. Alat elektroforesis dinyalakan (diberi
arus listrik) dengan tegangan 100 Volt selama 30 menit untuk DNA genom dan 20 menit untuk produk PCR. DNA akan bergerak dari muatan negatif menuju muatan positif.
3.4.3 Dokumentasi Gel
Komputer dan kamera digital dinyalakan. Gel agarosa hasil elektroforesis dimasukkan ke dalam UV transiluminator. UV transiluminator dinyalakan dan pita DNA akan berpendar saat terkenar sinar UV. Pendaran tersebut dapat didokumentasikan dengan software yang terhubung dengan kamera sehingga gambar yang ditangkap oleh kamera kemudian disimpan dalam komputer.
24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.4.4 Optimasi Suhu Annealing dengan menggunakan Metode Gradien PCR
Uji ini dilakukan untuk mengetahui suhu optimal primer babi dan primer sapi pada proses annealing. Pada PCR di setting pembuatan gradien suhu
annealing. Rentang suhu yang digunakan untuk pembuatan gradien suhu
annealing adalah 50-65oC.
3.4.5 Uji Spesifitas primer
Setelah didapat suhu annealing optimum dari primer babi dan primer sapi selanjutnya diuji spesifitasnya dengan menggunakan PCR. Primer babi dapat dikatakan spesifik jika primer babi hanya dapat mengamplifikasi sekuen DNA babi, begitu juga pada primer sapi yang hanya dapat mengamplifikasi sekuen DNA sapi.
3.4.6 Uji Sensitivitas primer
Primer babi dan primer sapi diuji sensitivitasnya dengan menggunakan PCR. Pengujian ini ditujukan untuk melihat konsentrasi terendah yang masih dapat terdeteksi dengan menggunakan primer babi dan primer sapi. Gradien konsentrasi yang digunakan yaitu 20 ng/ 25 µl, 10 ng/ 25 µl, 2 ng/ 25 µl, 0,2 ng/ 25 µl, dan 0,02 ng/ 25 µl.
3.4.7 Insulated Isothermal PCR
Optimasi alat insulated isothermal PCR dilakukan untuk mengetahui konsentrasi Taq polymerase, dNTP, buffer, primer, DNA template optimal untuk dapat mengamplifikasikan DNA babi dan DNA sapi. Uji ini dilakukan dengan campuran reaksi primer-probe, uni-ii buffer, probe, dNTP, DNA template, DNA polymerase.
Setelah campuran reaksi total PCR dibuat, campuran reaksi tersebut dimasukkan ke dalam R-tube, disentrifugasi, kemudian diletakkan pada mesin
insulated isothermal PCR. Kemudian program amplifikasi dijalankan dan hasil
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.5. Alur Penelitian
Persiapan daging babi segar dan daging sapi segar
Isolasi DNA
Cek keberadaan DNA dengan elektroforesis
DNA tidak ada DNA ada
Cek konsentrasi DNA
PCR 1. Optimasi Suhu Annealing 2. Uji spesifitas primer 3. Uji sensitivitas primer Insulated Isothemal PCR Hasil Kesimpulan
26 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
