2 TINJAUAN PUSTAKA
I, IIV-B,VI-B, VII-B
3.3 Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan terbagi menjadi tiga tahap, yaitu tahap persiapan, tahap orientasi prosedur uji dan tahap validasi metode. Tahap persiapan yang terdiri dari penyiapan bahan dan pengecekan unjuk kerja instrumen GC-FID, kemudian dilanjutkan dengan tahap orientasi uji sampel. Tahap terakhir adalah menvalidasi prosedur uji tersebut dengan beberapa parameter validasi metode analisis. Metode penelitian secara lengkap pada Gambar 3.1
Gambar 3.1 Tahapan penelitian 3.3.1 Tahap Persiapan
3.3.1.1 Penyiapan Bahan
Penyiapan bahan dilakukan dengan menyiapkan baku induk stiren dan baku internal dengan konsentrasi masing-masing 1000 µg/mL. Larutan baku induk stiren 1000 µg/mL dibuat dengan menimbang 25 mg stiren, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL dan tambahkan heptana sampai tanda batas. Larutan baku internal 1000 µg/mL juga dibuat sama dengan larutan baku stiren yaitu 25 mg 1,2,4,5-Tetrametilbenzenakemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 25mL dan tambahkan heptana sampai tanda batas.
Tahap 1. Persiapan Tahap 3. Validasi Metode Analisis Tahap 2. Orientasi Prosedur Uji Penyiapan Bahan : Larutan baku induk stiren
dan baku internal
Pengecekan unjuk kerja instrumen GC-FID : − Linieritas
− Presisi
− LOD dan LOQ
Analisis kandungan spesifik total residu monomer stiren pada
sampel (3 kali) Persiapan sampel polistiren
− Selektivitas − Linieritas − Akurasi − Presisi
3.3.1.2 Pengecekan unjuk kerja instrumen GC-FID
Pengecekan unjuk kerja instrumen GC-FID merupakan orientasi awal bahwa GC-FID dapat digunakan untuk mendeteksi stiren dengan kondisi dan parameter tertentu. Untuk mengetahui bahwa instrumen GC-FID tersebut dapat digunakan maka ditentukan kurva linearitas dan presisi dengan persyaratan yang telah ditetapkan.
Dalam menentukan linieritas instrumen, dibuat larutan baku kerja dengan 5 (lima) konsentrasi yang berbeda dari pengenceran larutan baku induk stiren 1000 µg/mL. Konsentrasi larutan baku kerja tersebut berturut-turut 1 µg/mL, 2 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL dan 20µg/mL. Masing-masing konsentrasi dibuat dengan memipet 10 µL, 20 µL, 50 µL, 100 µL dan 200 µL dari larutan baku induk stiren, ditambah larutan baku internal 50 µL dari larutan baku internal induk, kemudian ditambah heptana hingga tanda batas 10 mL dalam labu takar 10 mL (konsentrasi baku internal sekitar 5 µg/mL) dan dianalisis ke GC-FID sebanyak tiga kali
(triplo). Kurva linieritas y = ax + b untuk unjuk kerja instrumen merupakan hubungan antara konsentrasi baku kerja stiren dengan rasio luas area stiren dan baku internal.
Kondisi dan parameter GC-FID yang digunakan mengacu pada EU project PIRA (2003) untuk kondisi suhu oven dan jenis kolom dimodifikasi dengan penelitian Paraskevopoulou (2011) untuk suhu detektor dan injektor seperti pada Tabel 3.1.
LOD dan LOQ instrumen diperoleh dari percobaan linearitas instrumen tetapi yang diukur adalah rasio signal to noise (S/N) dari respon GC-FID untuk masing-masing konsentrasi yang berbeda. Selanjutnya besarnya rasio S/N tersebut diplotkan terhadap konsentrasi, dan dibuat persamaan kurva linier: y = ax + b. Berdasarkan kurva tersebut, kemudian dihitung nilai LOD adalah nilai x pada S/N= 3.00, sedangkan nilai LOQ adalah nilai x pada S/N=10.00.
3.3.2 Tahap Orientasi Prosedur Uji
3.3.2.1Persiapan sampel kemasan polistiren dan uji kandungan spesifik monomer stiren
Sampel kemasan kosong polistiren busa bentuk gelas pada bagian yang tidak mengandung tinta pewarna dipotong kecil dengan ukuran ± 0.50 × 0.50 cm2, kemudian ditimbang sebanyak ± 0.50 gram dalam gelas beaker 250 mL. Larutan simulan pangan dibuat dengan mencampurkan baku internal 250 µL dari baku internal induk 1024 µg/mL dan pelarut heptana sebagai simulan pangan hingga tanda batas 50 mL dalam labu ukur. Larutan simulan pangan tersebut kemudian dituangkan ke dalam gelas beaker 250 mL dan dimasukkan ke dalam waterbath
pada 49 oC. Setelah sekitar 10 menit larutan simulan sudah mencapai suhu 49 oC (ukur dengan termometer untuk memastikan), kemudian dituangkan ke dalam gelas beaker yang berisi sampel polistiren, tutup dengan gelas arloji dengan diameter hampir sama dengan diameter gelas beaker, sehingga sampel dalam keadaan terendam sempurna dalam larutan simulan pangan. Gelas beaker tersebut kemudian ditutup dengan menggunakan cawan petri yang berdiameter lebih besar daripada diameter gelas beaker dan segera dimasukkan ke dalam waterbath pada 49 oC suhu selama 15 menit seperti pada Tabel 2.3. Kemudian sampel dipisahkan
dari larutan simulan pangan. Larutan simulan pangan ini kemudian disebut larutan uji. Persiapan larutan uji tersebut dilakukan sebanyak 3 ulangan.
Tabel 3.1 Kondisi dan parameter GC-FID yang digunakan
3.3.2.2 Analisis konsentrasi stiren dalam sampel dari larutan uji
Larutan uji dianalisis dengan GC-FID sebanyak 2 (dua) kali analisis. Luas area stiren dari larutan uji digunakan untuk menghitung konsentrasi stiren dalam larutan sampel, menggunakan persamaan kurva linieritas dari hasil unjuk kerja instrumen. Lakukan 3 ulangan (triplo). Konsentrasi stiren dalam sampel dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
3.3.3 Tahap Validasi Metode Uji 3.3.3.1 Selektivitas (Selectivity)
Selektivitas dilakukan dengan membuat larutan sampel kemasan polistiren dalam pelarut heptana, larutan sampel kemasan polistiren dengan penambahan baku internal dalam pelarut heptana dan larutan sampel kemasan polistiren dengan penambahan baku stiren dan baku internal dalam pelarut heptana. Kemudian ke 3 (tiga) larutan tersebut dianalisis dengan GC-FID dan hasil kromatogramnya dibandingkan. Selektivitas metode analisis dinyatakan baik jika puncak senyawa stiren maupun baku internal terpisah dengan baik dan kedua puncak tersebut tidak diganggu dengan puncak senyawa cemaran dalam sampel yang terdeteksi dalam kromatogram.
Kolom Rtx-5 fused-silica column, 30 m x 0,25 mm ID, ketebalan film 0,25 µm R (Varian)
Split ratio 1:10 (setelah 5 menit)
Suhu oven 40°C selama 2 menit pertama kemudian meningkat 10°C/menit hingga 80°C, 20°C/menit hingga suhu akhir 180°C dan pertahankan selama 1 menit
Gas pembawa, aliran gas
Helium, 14 mL/menit Aliran udara 400 mL/menit
Aliran hidrogen 40 mL/menit Volume Injeksi 1 µL Suhu FID 250°C. Suhu injector 230ºC = Konsentrasi stiren dalam sampel µg/g
Konsentrasi (persamaan kurva) Berat sampel
x Faktor pengenceran x volume larutan sampel
3.3.3.2 Linieritas (Linearity)
Kurva liniearitas metode diperoleh dari analisis larutan baku kerja stiren dengan perlakuan sama seperti larutan uji yaitu perendaman waterbath pada 49 o
C selama 15 menit. Larutan baku kerja stiren dibuat dengan 6 konsentrasi baku kerja stiren yang berbeda yaitu 5 konsentrasi sesuai dengan konsentrasi untuk kurva linieritas unjuk kerja instrumen (1 µg/mL, 2 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 20 µg/mL) dan 1 konsentrasi di bawah hasil pengukuran sampel pada tahap orientasi prosedur uji yaitu 0.50 µg/mL. Dalam baku kerja tersebut masing- masing mengandung baku internal dengan konsentrasi 5 µg/mL. Kurva linieritas metode dibuat dengan memplotkan rasio area (stiren dan baku internalnya) sebagai sumbu y terhadap konsentrasi stiren sebagai sumbu x, sehingga diperoleh persamaan linier y = ax + b. Persyaratan linieritas untuk metode analisis adalah mempunyai R2> 0.990 atau r > 0.995 (AOAC 2012).
3.3.3.3 Presisi (Precision)
Penentuan presisi metode dilakukan dengan melakukan analisis kadar stiren pada larutan uji sebanyak 7 (tujuh) ulangan dan analisis dengan GC-FID masing- masing dilakukan 2 kali. Konsentrasi stiren dalam sampel ditentukan dari kurva linieritas metode kemudian ditentukan nilai rata-rata konsentrasinya dan nilai RSD-nya. Persyaratan presisi metode adalah mempunyai nilai RSD sampel 2/3 x % RSD Horwitz.
3.3.3.4 Akurasi (Accuracy)
Penentuan akurasi metode ditentukan dari pengujian seperti untuk penentuan presisi, namun selain larutan juga ditambahkan larutan baku stiren 250 µL dari baku stiren induk kemudian ditambahkan heptana hingga 50 mL. Pembuatan larutan tersebut dilakukan 7 (tujuh) ulangan, dan analisis dengan GC- FID sebanyak 2 (dua) kali. Konsentrasi stiren dihitung dengan menggunakan kurva linieritas stiren metode. Perbandingan nilai konsentrasi stiren yang terukur (setelah dikurangi dengan konsentrasi dalam sampel) dengan konsentrasi baku stiren yang ditambahkan merupakan recovery, dengan rumus sebagai berikut :
Persyaratan recovery berdasarkan AOAC (2012) pada konsentrasi sekitar 100 µg/g adalah 85–110 %.
3.3.4.5 LOD dan LOQ
Diperoleh dari kurva linearitas validasi metode uji, dengan prinsip perhitungan seperti pada penentuan LOD dan LOQ alat.
% Recovery = Konsentrasi hasil pengukuran - konsentrasi sampel