Lokasi dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan di Bagian Teknologi Hasil Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Pelaksanaan penelitian dilakukan pada bulan Februari sampai September 2009.
Materi
Sampel susu yang digunakan merupakan sampel individu yang diperoleh dari bangsa kambing Peranakan Etawah (PE) 3 ekor dan Jawarandu 3 ekor, masing-masing digunakan 500 ml susu. Susu kambing tersebut diperoleh dari peternakan di Bogor. Lokasi pengambilan sampel susu kambing PE yaitu di peternakan perseorangan, Cimahpar (Bogor Utara) yang diberi pakan hijauan berupa rumput lapang dan konsentrat berupa ampas tahu, sedangkan sampel susu kambing Jawarandu diperoleh juga dari peternakan perseorangan di Ciapus, pakan yang digunakan adalah rumput lapang, ampas tahu dan kurma.
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian meliputi bahan kimia untuk uji kualitas susu dan penentuan kadar laktoferin. Bahan-bahan tersebut yaitu H2SO4 91-92%, fenolftalein, NaOH 0,25 N, NaOH 0,1 N, NaOH 2 N, formalin 40%, 0,4 ml kalium oksalat jenuh, amil alkohol, air deionisasi, NaCl, HCl, NaOH, ethanolamine 20 mmol/L. Buffer yang digunakan adalah Buffer A: ethanolamine 20 mmol/L pH 9,5 dan Buffer B: ethanolamine 20 mmol/L pH 9,5 + NaCl 1 M. Elution buffer yang digunakan adalah gradien Buffer A 100%, Buffer A 90% + Buffer B 10%, Buffer A 80% + Buffer B 20%, Buffer A 70% + Buffer B 30%, Buffer A 60% + Buffer B 40%, Buffer A 50% + Buffer B 50%, dan Buffer A 40% + Buffer B 60%. Setiap fraksi protein yang dihasilkan diperiksa dengan menggunakan spektrofotometer (280 nm).
Peralatan yang digunakan adalah autoclave, inkubator, refrigerator, freezer, pemanas Bunsen, high speed centrifuge (sentrifugasi dingin Hettich Zentrifugen Mikro 200R), membran dialisis, penukar kation kromatografi dengan menggunakan Hi-Trap Q-SP (GE Healthcare), magnetic stirer, microtube 2 ml dan 25 ml, spektrofotometer Genesys UV10R, Corning Steril Syringe Filter 0,2 µm, penangas air, kompor listrik, pipet volumetrik, mikropipet, butirometer, penyumbat karet,
laktodensimeter, pH meter, buret, gelas ukur, gelas piala, labu Erlenmeyer, tabung reaksi, timbangan analitik, alat destilasi, pendingin Liebig, jangka sorong, rak tabung reaksi, centricon, alumunium foil dan kertas serap.
Rancangan
Rancangan percobaan yang digunakan untuk menentukan kandungan nutrisi susu kambing dan kandungan laktoferin adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial (2×3) dengan tiga ulangan dengan perlakuan bangsa kambing perah (PE dan Jawarandu) dan hari pemerahan yang berbeda. Model matematika rancangan penelitian menurut Gasperz (1989) :
Yijk = µ + αi + (αβ)ij + ε(ijk)
Keterangan :
Yijk = hasil pengamatan kandungan laktoferin pada bangsa kambing
perah ke-i dan kelompok ke-j µ = nilai tengah umum
αi = pengaruh perbedaan bangsa kambing perah ke-i βj = pengaruh hari pemerahan susu ke-j
(αβ)ij = pengaruh interaksi antara bangsa kambing perah yang berbeda ke-i dengan hari pemerahan susu ke-j
i = bangsa kambing perah yang berbeda
j = hari pemerahan
ε ij = pengaruh galat percobaan dari satuan percobaan ke-k yang memperoleh kombinasi perlakuan ij
Data kandungan nutrisi susu kambing dan kandungan laktoferin yang didapat pada masing-masing individu kambing dianalisis dengan menggunakan sidik ragam. Apabila hasilnya nyata maka dilanjutkan dengan uji Tukey (Steel dan Torrie, 1995). Peubah
Peubah yang diamati meliputi kandungan nutrisi susu kambing dan konsentrasi laktoferin dalam susu.
Kandungan Nutrisi Susu Kambing. Kandungan nutrisi susu kambing perah dapat dilihat dari komposisi susu yang dihasilkan. Penentuan kualitas kimia susu kambing
dapat dilihat melalui komposisinya yang meliputi kadar protein, kadar lemak, kadar bahan kering, berat jenis, nilai pH dan bahan kering tanpa lemak.
Kandungan Laktoferin. Whey yang dihasilkan dari sentrifugasi dilakukan pengujian kromatografi untuk mengetahui kadar isolat laktoferin yang terkandung dalam whey tersebut. Hasil kromatografi dapat menunjukkan kandungan isolat laktoferin yang berbeda tergantung dari whey kambing perah yang digunakan. Konsentrasi laktoferin pada fraksi protein hasil kromatografi diperoleh dari nilai absorbance pada 280 nm dikali faktor yang diestimasi dari laktoferin sapi standar dari Sigma Aldrinch Co.
Konsentrasi Laktoferin (%) = Nilai Absorbance pada 280 nm x 0,07 Prosedur
Pengumpulan Sampel Susu. Sampel susu yang digunakan merupakan sampel individu yang diperoleh dari berbagai bangsa kambing. Susu yang dianalisa antara lain bangsa PE dan Jawa Randu. Susu kambing tersebut diperoleh dari peternakan Bapak Iwan di Ciapus, Bogor. Sampel susu diperoleh dalam kondisi beku dan diangkut dengan menggunakan cool box ke laboratorium. Sampel untuk uji kualitas fisik dan kimia disimpan pada kondisi dingin, sedangkan untuk pengukuran laktoferin jika tidak langsung diuji bisa dibekukan.
Pengukuran Nilai pH (BSN, 1992). Susu kambing contoh yang diperlukan untuk setiap pengukuran adalah 60 ml yang diletakkan dalam gelas ukur. Sebelum pengukuran, pH meter dikalibrasi terlebih dahulu dengan menggunakan larutan buffer pH 4 dan 7, karena pH susu normalnya berada pada ±6,6. Pengukuran dilakukan dengan mencelupkan ujung elektroda pH meter ke dalam susu kambing selama beberapa menit hingga nilai pH pada layar stabil.
Pengukuran Berat Jenis (BSN, 1998). Susu kambing dihomogenkan secara sempurna, kemudian sebanyak 500 ml dimasukkan ke dalam gelas ukur. Laktodensimeter dengan hati-hati dicelupkan ke dalam susu, dibiarkan timbul dan ditunggu sampai diam. Skala dan temperatur susu yang ditunjukkan laktodensimeter tersebut dibaca, selanjutnya dilihat tabel penyesuaian berat jenis susu yang diuji pada temperatur 27,5 ºC.
Pengukuran Kadar Lemak Susu Metode Gerber (BSN, 1998). Susu kambing diambil menggunakan pipet sebanyak 10,75 ml ke dalam botol butirometer, ditambahkan H2SO4 91-92% sebanyak 10 ml dan 1 ml amil alkohol. Butirometer tersebut disumbat rapat, kemudian dikocok perlahan sampai larutan homogen. Setelah terbentuk warna ungu tua sampai kecoklatan, tabung butirometer dimasukkan ke dalam sentrifuge dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 1200 rpm. Tabung butirometer yang telah disentrifugasi dimasukkan ke dalam penangas air selama 5 menit dengan temperatur 65ºC. Setelah itu kadar lemak dibaca spada skala butirometer.
Uji Titrasi Keasaman Soxhlet Henkel (BSN, 1998). Sebanyak 50 ml sampel susu kambing diambil menggunakan pipet ke dalam labu Erlenmeyer, ditambah 2 ml larutan fenolftalein. Salah satu dari campuran pada labu Erlenmeyer dititrasi dengan menggunakan larutan NaOH 0,25 N hingga terbentuk warna merah muda yang tidak hilang lagi jika dikocok. Derajat Soxhlet (ºSH) adalah banyaknya ml NaOH 0,25 N yang dipakai dikalikan nilai 2.
Pengukuran Kadar Protein Susu (Davide, 1977). Pengujian kadar protein susu dilakukan dengan menggunakan metode Titrasi Formol. Sebanyak 10 ml susu dimasukkan dalam labu Erlenmeyer kemudian ditambahkan beberapa tetes fenolftalein 1% dan 0,4 ml kalium oksalat jenuh. Titrasi dengan larutan NaOH 0,1 N sampai timbul warna merah muda. Sebanyak 2 ml formalin 40% ditambahkan, warna merah akan hilang. Titrasi kembali dengan larutan NaOH 0,1 N sampai warna merah muda terjadi. Banyaknya NaOH 0,1 N yang digunakan dicatat.
Titrasi blanko dibuat dengan cara sebanyak 10 ml aquadest ditambah dengan 0,4 ml kalium oksalat jenuh kemudian 2 ml formalin 40% dan beberapa tetes fenolftalein 1% ditambahkan. Titrasi dengan NaOH 0,1 N sampai terbentuk warna merah muda. Banyaknya NaOH 0,1 N yang digunakan kemudian dicatat. Rumus perhitungan kadar protein susu adalah:
Kadar Protein Susu = (p-q) ml x 1,95 (faktor formol)
Pemisahan Lemak dan Kasein. Lemak susu kambing dipisahkan berdasarkan Yoshida et al. (2000) yaitu dengan sentrifugasi 2.000×g pada suhu 4°C selama 30 menit. Susu skim yang dihasilkan diasamkan hingga pH 4,6 dengan penambahan 2 N
HCl dan disentrifugasi 10.000×g pada suhu 4°C selama 30 menit. Endapan kasein dibuang, whey asam yang dihasilkan dinetralisasi ke pH 6,8 dengan 2 N NaOH dan disentrifugasi kembali pada 10.000×g pada suhu 4°C selama 30 menit. Endapan yang tersisa dibuang sehingga diperoleh whey netralisasi yang bersih dan dapat dibekukan dalam freezer untuk digunakan pada analisis selanjutnya.
Identifikasi Laktoferin dari Protein Whey. Susu yang digunakan dalam isolasi laktoferin adalah susu dari bangsa kambing perah Peranakan Etawa (PE) dan Jawarandu. Whey protein diisolasi dengan Hi–Trap Q–SP Anion Exchange Column (GE–Healthcare) dengan gradien NaCl linier. Buffer yang digunakan adalah Buffer A (ethanolanime 20 mmol/L pH 9,5) dan Buffer B (ethanolanime 20 mmol/L pH 9,5 + NaCl 1 M).
Susu normal Krim susu dari masing-masing ternak kambing dipisahkan melalui sentrifugasi (2000×g, 30 menit pada suhu 4°C)
Skim susu normal
Ditambahkan 2 N HCl hingga pH 4,6 pada suhu ruang, presipitasi yang terbentuk (kasein) dipisahkan dengan sentrifugasi (10.000×g, 30 menit pada suhu 4°C)
Whey asam
Netralisasi hingga pH 6,8 dengan 2N NaOH. Presipitasi yang terbentuk dipisahkan dengan sentrifugasi (10.000×g, 30 menit, 4°C)
Netralisasi Whey Asam
(susu normal)
Hi-Trap Q-SP Anion Exchange Column Dengan gradien NaCl Linier
Buffer A: ethanolamine 20 mmol/L pH 9,5
Buffer B: ethanolamine 20 mmol/L pH 9,5 + NaCl 1 M
Laktoferin
Rechromatografi dengan Hi-Trap Q-SP Anion Exchange Column
Lyiophilisasi
Gambar 4. Diagram Alir Isolasi Laktoferin (Yoshida et al., 1991)
Penghitungan Konsentrasi Laktoferin. Konsentrasi laktoferin pada fraksi protein hasil kromatografi diperoleh dari nilai absorbance pada 280 nm dikali faktor yang diestimasi dari laktoferin sapi standar dari Sigma Aldrich Co.