BAB III METODOLOGI PENELITIAN
E. Metode Penelitian
1. Determinasi tanaman dengan cara membandingkan ciri dan sifat
Determinasi daun benalu dilakukan di Bagian Biologi Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dengan cara membandingkan ciri dan sifat sampel dengan buku Flora of Java. Determinasi dilakukan oleh determinator Bapak Djoko Santosa, M.si. Determinasi tanaman ini untuk memastikan bahwa yang digunakan untuk penelitian benar-benar daun benalu S.atropurpurea (B1.) Dans.
2. Pembuatan dan penyiapan bahan a. Pengumpulan bahan
Daun benalu kemiri diambil dari pohon kemiri yang terdapat di sekitar halaman kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan (Yogyakarta). Pengumpulan pada bulan Juli tahun 2014. Pemanenan dilakukan pagi hari pukul 09.00 WIB.
b. Sortasi basah
Daun benalu dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu seperti bagian tanaman yang tidak dibutuhkan (ranting, bunga dan akar) dan bahan-bahan rusak lainnya.
c. Pencucian
Daun benalu dicuci dengan cara dialiri air mengalir sambil dibersihkan dari kotoran yang melekat.
d. Pengeringan
Daun benalu yang masih basah dikeringan dengan cara dijemur dibawah sinar matahari dan ditutupi dengan kain hitam. Akhir pengeringan ditandai dengan mudah dipatahkannya bagian per bagian daun benalu tersebut.
e. Sortasi kering
Daun benalu yang sudah kering ditandai dengan mudah hancur ketika diremas kemudian dipisahkan dari bahan-bahan penggangggu seperti bagian batang dan bahan-bahan yang rusak (tanpa pencucian).
f. Perajangan atau pembuatan serbuk simplisia
Daun benalu yang sudah kering dibuat menjadi serbuk dengan blender lalu dilakukan pengayakan dengan ayakan nomor mesh 40.
g. Pengepakan dan penyimpanan
Serbuk daun benalu kemiri kemudian disimpan diwadah yang kedap udara dan disimpan ditempat kering dan sejuk.
3. Preparasi Sampel a. Ekstraksi sampel
Daun benalu kemiri yang telah menjadi serbuk ditimbang sebanyak 30,0 g dan dimasukkan ke dalam bejana maserasi ukuran 300 ml, ditambah dengan 100 ml etanol 70 % sampai terendam sempurna dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama tiga hari dengan alat shaker. Filtrat diperoleh melalui penyaringan menggunakan kertas saring kasar dengan bantuan corong Buchner dan pompa vakum. Ampas penyaringan diremaserasi dengan 100 ml etanol 70 % kembali selama dua hari. Kemudian filtrat yang didapat dicampur dengan filtrat terdahulu. Keseluruhan filtrat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental etanol daun benalu kemiri. Selanjutnya ekstrak kental di letakkan di atas waterbath hingga bobot tetap.
4. Pembuatan fraksi etil asetat
Ekstrak etanol daun benalu kemiri dilarutkan dalam 300 ml air hangat dan dilakukan ekstraksi cair-cair menggunakan washbensin dengan perbandingan larutan ekstrak : wash bensin (1:1 v/v), diamkan hingga terpisah sempurna. Fase air akan berada dibawah sedangkan fase wash bensin akan berada diatas. Dari hasil ekstrasi tadi diperoleh dua fraksi yaitu air dan
wash bensin.
Fraksi yang diambil yaitu fraksi air untuk kemudian diekstraksi dengan menggunakan etil asetat p.a (1:1 v/v), sehingga didapatkan fraksi air dan
fraksi etil asetat. Ambil fraksi etil asetat. Kemudian fraksi etil asetat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator dan selanjutnya diletakkan diatas waterbath hingga bobot tetap. Fraksi yang didapat disimpan didalam desikator hingga digunakan untuk analisis lebih lanjut.
5. Pembuatan larutan pembanding, DPPH dan uji a. Pembuatan larutan uji
1. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total
Sebanyak 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang, lalu dilarutkan dengan 10,0 mL metanol p.a sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 1000,0 µg/mL. Kemudian sebanyak 1,0 mL larutan tersebut dilarutkan dengan 10,0 mL metanol p.a sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100,0 µg/mL.
2. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan
Sebanyak 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL sebagai larutan stok. Kemudian dibuat larutan intermediet, sebanyak 1,0 mL stok larutan uji dan dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0 g/mL. Sebanyak 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75 mL larutan tersebut, kemudian dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 7,5; 10,0; 12,5; 15,0; 17,5
3. Pembuatan larutan baku asam galat
Sebanyak 10,0 mg asam galat ditimbang, lalu dilarutkan dengan 10,0 mL akuades : metanol p.a (1:1) sehingga diperoleh konsentrasi larutan asam galat sebesar 1000,0 µ g/mL. Sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 dan 1,5 mL larutan tersebut, kemudian dilarutkan dengan akuades : metanol p.a (1:1) sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 µg/mL.
b. Pembuatan larutan DPPH
Sebanyak 0,0158 g DPPH dilarutkan dengan metanol p.a sampai 100 mL sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.
c. Pembuatan larutan stok dan intermediet kuersetin
Sebanyak 10,0 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL sebagai larutan stok. Kemudian dibuat larutan intermediet, sebanyak 1,0 mL larutan stok kuersetin dan dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0 g/mL. Sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 mL larutan kuersetin konsentrasi 100,0 g/mL, kemudian dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan pembanding kuersetin sebesar 5,0; 7,5; 10,0 12,5; dan 15,0
6. Uji Pendahuluan
A. Uji pendahuluan kandungan fenolik total a. Larutan Blanko
Sebanyak 10,0 mL akuades : metanol p.a (1:1) dimasukkan kedalam tabung reaksi lalu ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin- Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1 :10 v/v). Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan 4 mL natrium karbonat 1 M. b. Kontrol Positif
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian dilarutkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1 :10 v/v). Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan 4 mL natrium karbonat 1 M. Vortex selama 15 detik. Amati perubahan warna yang terjadi.
c. Larutan uji
Sebanyak 0,5 mL larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian dilarutkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1 :10 v/v). Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan 4 mL natrium karbonat 1 M. Vortex selama 15 detik. Amati perubahan warna yang terjadi.
d. Larutan Asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 10,0 mL akuades : metanol p.a (1:1)
e. Larutan uji
Sebanyak 0,5 mL larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 10,0 mL akuades : metanol p.a (1:1) B.Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
a. Larutan kuersetin
Sebanyak 10,0 mg kuersetin dimasukkan kedalam tabung reaksi lalu dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL
b. Larutan Uji
Sebanyak 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL di dalam tabung reaksi. c. Larutan DPPH
Sebanyak 1 mL larutan DPPH dilarutkan dengan 3 mL metanol p.a dimasukkan kedalam tabung reaksi dan divortex selama 30 detik
d. Larutan uji + DPPH
Sebanyak 1 mL larutan uji ditambahkan 1 mL larutan DPPH dimasukkan kedalam tabung reaksi kemudian dilarutkan dengan 3 mL metanol p.a dan vortex selama 30 detik. Selama 30 menit diamati perubahan warna yang terjadi.
Larutan kuersetin + DPPH
Sebanyak 1 mL larutan pembanding kuersetin ditambahkan 1 mL larutan DPPH, dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian dilarutkan dengan 3 mL metanol p.a dan vortex selama 30 detik. Selama 30 menit e.
diamati perubahan warna yang terjadi.
7. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total a. Penentuan operating time (OT) asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 µ g/mL dilarutkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang teoritis 750 nm selama 30 menit dengan waktu pengamatan setiap 5 menit. Hasil percobaan dapat dilihat di Lampiran 6.
b. Penentuan panjang gelombang maksimum asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 µ g/mL ditambahkan dengan 5,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M dan diamkan selama operating time, kemudian di scanning dengan spektrofotometer visibel pada rentang panjang gelombang antara 600-800 nm. Hasilnya dapat dilihat pada lampiran 6.
8. Penetapan kandungan fenolik total a. Pembuatan seri baku asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 g/mL ditambah dengan 5,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Larutan selanjutnya
ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M lalu diamkan selama operating time setelah itu dibaca pada panjang gelombang maksimum yang didapat 739 nm. Pengerjaan dilakukan tiga kali. b. Pembuatan kurva baku asam galat
1. Membuat seri larutan baku asam galat dengan konsentrasi 50, 75, 100. 125 dan 150 g/mL
2. Masing-masing seri larutan baku asam galat dengan konsentrasi diatas diukur nilai absorbansinya pada = 739 nm
3. Mencatat nilai absorbansi masing-masing seri larutan baku asam galat
4. Membuat kurva standar hubungan konsentrasi vs absorbansi 5. Selanjutnya masukkan ke persamaan regresi linier kurva baku
Y=bx+a hasilnya dapat dilihat pada lampiran 7.
c. Validasi metode penetapan fenolik total asam galat. Hasil dari prosedur 8a divalidasi berdasarkan presisi (%CV) dan linearitas (nilai r).
% � =� � � � � − � � ��� � � � � � � � � � � %
d. Penetapan kandungan fenolik total larutan uji
Sebanyak 0,5 mL larutan uji dengan konsentrasi 102 g/mL, kemudian ditambah dengan 5,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1M lalu diamkan selama operating time, dibaca pada panjang gelombang maksimum yang
didapat 739 nm. Pengerjaan dilakukan tiga kali Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat ekstrak etanol. Hasil penetapan kandungan fenolik total dapat dilihat di lampiran 7.
9. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan e. Penentuan operating time (OT)
Sebanyak 2,0 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masing-masing tiga labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing-masing-masing dengan 2,0 mL larutan pembanding kuersetin 5,0; 10,0 dan 15,0 g/mL Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 515 nm selama 1 jam, dan hal diatas dikerjakan juga untuk larutan uji dengan konsentrasi 7,5; 12,5; 17,5 g/mL. Hasilnya ada di lampiran 10.
f. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Pada tiga labu ukur 10 mL, dimasukkan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL larutan DPPH 0,4 mM. Larutan tersebut dilarutkan dengan metanol p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,060 mM. Larutan tersebut kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik. Diamkan selama operating time, kemudian di scanning dengan spektrofotometer visibel pada rentang panjang gelombang antara 400-600 nm.
10. Uji aktivitas antioksidan
a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol)
Pada labu ukur 10 mL, dimasukkan sebanyak 2,0 mL larutan DPPH lalu dilarutkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji larutan pembanding dan uji.
b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji
Larutan DPPH sebanyak 2,0 mL dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL kemudian ditambah dengan 2,0 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai konsentrasi yang telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut dilarutkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik dan didiamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakukan dengan tiga kali optimasi.
c. Penetapan aktivitas antioksidan
Dari hasil dari pengukuran absorbansi 10 b dihitung nilai %IC dan IC50 untuk kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri.