METODE PENELITIAN

Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis ISOLAT

Antigen Protoplasmik Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis Isolat Lapang (PPA-L)

Bakteri MAP B2789 ditumbuhkan pada media Watson Reid’s dimodifikasi (mWR), kemudian diinkubasikan pada suhu 37 oC selama 16 minggu. Setelah bakteri tumbuh baik pada permukaan media, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10,000 rpm selama 30 menit. Pelet dicuci tiga kali dengan 10 mM phosphat buffer saline (PBS) pH 7.2. Pelet dilarutkan kembali dengan PBS, kemudian ditambahkan 0.05% (vol/vol) protease inhibitor cocktail (Sigma, USA), dan selanjutnya dihomogenisasi. Suspensi disonikasi tiga kali dalam

23 keadaan dingin selama 30 menit. Untuk memisahkan komponen dinding sel dan sisa-sisa sel, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 30.000 rpm selama 30 menit. Supernatan dikoleksi, kemudian difiltrasi dengan membran filter ukuran 0.22 µm, dan selanjutnya diukur konsentrasi proteinnya dengan menggunakan metode Bradford dan disimpan pada suhu -20 oC sampai digunakan.

Antigen Mycobacterium phlei (Absorben)

Bakteri Mycobacterium phlei (M. phlei) B0666 ditumbuhkan pada Sauton media (SM), kemudian diinkubasikan pada suhu 37 oC selama delapan minggu. Setelah bakteri tumbuh baik pada permukaan media, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10,000 rpm selama 30 menit. Pelet dicuci tiga kali dengan 10 mM PBS pH 7.2. Pelet dilarutkan kembali dengan PBS dan dihomogenisasi. Suspensi disonikasi tiga kali dalam keadaan dingin selama 30 menit. Untuk memisahkan sisa-sisa sel, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10,000 rpm selama 30 menit. Supernatan dikoleksi, kemudian difiltrasi dengan membran filter 0,22 µm, dan selanjutnya diukur konsentrasinya dengan menggunakan metode Bradford dan disimpan pada suhu -20 oC sampai digunakan. Antigen ini yang digunakan untuk mengabsorsi serum kontrol dan serum sampel dengan tujuan untuk meminimalkan atau menghilangkan reaksi nonspesifik.

Serum

Serum sapi positif paratuberkulosis (kultur feses positif) yang digunakan dalam penelitian ini ada sebanyak 22 sampel, yang berasal dari Balai Besar Penelitian Veteriner (BB Litvet): 11 sampel, Laboratorium Service International (LSI), Perancis: 5 sampel, dan Allied Paratuberculosis Laboratorium: 6 sampel, sedangkan serum negatif paratuberkulosis yang digunakan merupakan koleksi BB Litvet sebanyak 300 sampel.

Agar gel immunodiffusion (AGID)

Teknik ini akan digunakan untuk menguji serum kontrol dengan antigen protoplasmik MAP isolat lapang, dengan tujuan untuk mengetahui seroreaktifitas kedua komponen tersebut. Agarose sebanyak 0.75 g dilarutkan ke dalam 100 ml larutan yang terdiri dari 0.9 g borate, 0.2 g sodium hidroxide, 0.01 sodium azide (pH 8.5-9.0). Campuran dipanaskan dalam microwave dan kemudian dituangkan pada petri dish ukuran 90 mm sebanyak 15 ml, selanjutnya didinginkan dan dibuat lubang berbentuk hexagonal dengan diameter 4 mm, kedalaman 3-4 mm dan jarak antar lubang 2 mm. Antigen sebanyak 30 µl dimasukkan ke dalam lubang bagian tengah, kemudian lubang lain diisi dengan serum kontrol positif dan negatif dengan volume yang sama, diinkubasikan pada suhu ruang dengan keadaan lembab selama 24-48 jam.

Optimasi ELISA Paratuberkulosis dengan Menggunakan Antigen Protoplasmik MAP Isolat Lapang

Titrasi dilakukan terhadap antigen, serum, dan konjugat dengan tujuan untuk mendapatkan pengenceran dan hasil yang optimal. Titrasi terhadap antigen dan serum kontrol (positif dan negatif) dilakukan dengan pengenceran 1-12 µg/ml untuk antigen dan 1/50-1/3,200 untuk serum. Pengenceran antigen dimasukkan pada kolom mikroplat nomor 1-12 dan serum pada lajur mikroplat A-H. Titrasi

konjugat dilakukan dengan pengenceran 1/1,000-1/8,000 yang dimasukkan pada kolom mikroplat nomor 1-6 dan lajur A-D untuk pengenceran 1/1,000, untuk pengenceran 1/2,000 pada kolom 7-12 dan lajur A-D, untuk pengenceran 1/4,000 pada kolom 1-6 dan lanjur E-H, dan untuk pengenceran 1/8,000 pada kolom 7-12 dan lajur E-H.

Prosedur ELISA dengan Menggunakan Antigen Protoplasmik MAP Isolat Lapang (ELISA PPA-L)

Prosedur uji ELISA ini dilakukan sesuai dengan hasil titrasi. Antigen PPA-L (5 µg/ml) dilarutkan dalam carbonat bicarbonat buffer (1.59 g Na2CO3;

2.93 g NaHCO3, pH 9.6), dan kemudian dimasukkan 100 µl ke dalam setiap

lubang mikroplat (Maxisorp, Nunc, Denmark), selanjutnya mikroplat ditutup dengan plastik adesif dan diinkubasikan semalam pada suhu 4 oC. Mikroplat dicuci tiga kali dengan phosphat buffer saline tween 0.05% (PBST) pH 7.4 (8.0 g NaCl; 0.2 g KCl; 0.272 KH2PO4; 1.44 g Na2HPO4; 500 µl Tween 20). Kemudian

mikroplat dibloking dengan 200 µl PBST-bovine serum albumin (PBST-BSA) 2.0% untuk setiap lubang, kemudian diinkubasikan pada suhu ruang selama dua jam. Mikroplat dicuci kembali, dan serum dilarutkan 1:100 dalam PBST-BSA 1.0% yang mengandung antigen Mycobacterium phlei (250 µg/ml), selanjutnya diinkubasikan 30 menit pada suhu ruang. Serum kemudian dimasukkan 100 µl ke dalam setiap lubang mikroplat, kemudian diinkubasikan satu jam pada suhu ruang. Mikroplat dicuci kembali dan selanjutnya konjugat rabbit anti-bovine IgG HRP (Jackson Immunoresearch, USA) dilarutkan 1:3,000 dalam PBST-BSA 1.0%, kemudian dimasukkan 100 µl ke dalam setiap lubang mikroplat, selanjutnya diinkubasikan selama satu jam pada suhu ruang. Setelah mikroplat dicuci, substrate TMB (Sigma, USA) dalam phosphat citrate buffer pH 5.0 (0.2 M Na2HPO4, 0.1 M citric acid) dimasukkan 100 µl ke dalam setiap lubang,

kemudian diinkubasikan 15 menit pada suhu ruang dan pada tempat gelap. Setelah itu, stop solution (0.5 M H2SO4) sebanyak 100 µl dimasukkan ke dalam setiap

lubang mikroplat. Pembacaan dilakukan dengan microplate reader (Multiscan EX, Thermoscientific) pada panjang gelombang 450 nm. Nilai optical density (OD) dikonversi ke S/P rasio dengan menggunakan rumus, S/P = (OD sampel-OD kontrol negatif)/(OD kontrol positif-OD kontrol negatif). Rataan nilai S/P rasio digunakan untuk analisa data. Pengujian dikatakan valid jika nilai OD kontrol positif/OD kontrol negatif (P/N rasio) di atas atau sama dengan 5.0 dan nilai OD kontrol negatif kurang dari 0.2.

Prosedur ELISA Kit IDEXX Paratuberculosis Screening Antibody Test.

Prosedur uji kit ELISA ini sesuai dengan petunjuk pembuatnya, yaitu semua reagen diletakkan dalam suhu ruang selama kurang lebih 30 menit sebelum digunakan. Sampel dan kontrol dilarutkan dalam sample buffer (N.12) (mengandung antigen Mycobacterium phei) dengan perbandingan 1:20, kemudian dihomoginisasi dan diinkubasikan selama 15 menit pada suhu ruang. Selanjutnya 100 µl dimasukkan ke dalam tiap lubang mikroplat, untuk kontrol positif pada A1-B1, kontrol negatif C1, dan sampel pada lubang yang lain. Mikroplat ditutup dengan plastik adesif, kemudian diinkubasikan pada suhu ruang selama 45 menit. Setelah masa inkubasi selesai, mikroplat dicuci tiga kali dengan wash solution. Konjugat anti-ruminant IgG HRP dilarutkan dalam conjugate buffer (N.1) 1:100

25 dan dimasukkan 100 µl ke dalam tiap lubang, kemudian mikroplat ditutup dengan plastik adesif dan diinkubasikan pada suhu ruang selama 30 menit. Kemudian dicuci kembali, substrate tetramethyl benzidine (TMB) (N.9) dimasukkan100 µl ke dalam tiap lubang mikroplat, diinkubasikan selama 10 menit pada suhu ruang dan pada tempat gelap. Stop solution (N.3) dimasukkan 100 µl ke dalam tiap lubang mikroplat, dan diukur absorbansinya menggunakan microplate reader (Multiscan EX, Thermoscientific) pada panjang gelombang 450 nm. Hasil uji dikatakan valid jika rataan nilai optical density (OD) kontrol positif lebih atau sama dengan 0.35 dengan P/N ratio lebih atau sama dengan 3.0. Kalkulasi hasil dihitung dengan mengkonversi OD ke S/P % dengan rumus S/P = (OD sampel- OD kontrol negatif)/(rataan OD kontrol positif-OD kontrol negatif) x 100. Intepretasi hasil, dikatakan negatif jika S/P % kurang atau sama dengan 45, meragukan jika nilai S/P% antara 45-55 dan positif jika S/P% lebih atau sama dengan 55.

Evaluasi ELISA.

Senstivitas dan spesifitas uji ELISA ditentukan dengan menguji serum positif paratuberkulosis (kultur feses positif) dan serum negatif paratuberkulosis.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Untuk mengetahui seroreaktifitas serum kontrol paratuberkulosis terhadap antigen protoplasmik MAP isolat lapang, sampel diuji dengan agar gel immunodiffusion. Hasil uji positif ditunjukkan adanya garis putih (presipitin) yang merupakan reaksi antara antigen dan antibodi paratuberkulosis (Gambar 5).

Gambar 5 Hasil agar gel immunodiffusion (AGID) untuk pengujian serum kontrol. Lubang A,C kontrol positif BB Litvet 1,2; lubang B kontrol positif Allied Laboratories; lubang D,F kontrol negatif BB Litvet 1,2; lubang E kontrol negatif Allied Laboratories; lubang G antigen PPA MAP isolat lapang (PPA-L).

E F A B C D G

Hasil di atas menunjukkan bahwa ada reaksi yang spesifik antara antigen protoplasmik MAP isolat lapang dengan serum kontrol positif, baik yang berasal dari BB Litvet maupun serum reference, sedangkan untuk serum negatif tidak ada reaksi antara antigen dan antibodi. Uji AGID ini dilaporkan cukup spesifik dan sebagai uji konfirmasi untuk sampel serum sapi, domba, atau kambing yang secara klinis terindikasi paratuberkulosis (Ferreira et al. 2002; Robbe-Austerman et al. 2006). Menurut OIE (2012), pada sapi yang secara histologi terindikasi paratuberculosis, sensitivitasnya 38.0-56.0% (95% CI) dengan spesifitas 99.0- 100.0% (95% CI). Sedangkan menurut Ferreira et al. (2002), bahwa untuk menguji pada kasus paratuberkulosis subklinis metode ini kurang memuaskan.

Hasil titrasi terhadap antigen, serum, dan konjugat yang memberikan hasil optimal adalah pada pengenceran serum 1/100, konjugat 1/3,000, dan konsentrasi antigen 5 µg/ml (Tabel 4).

Tabel 4 Nilai optical density (OD) hasil titrasi terhadap antigen, serum, dan konjugat

Serum Nilai Optical Density (OD)

BB Litvet 1 Positif 1.503

Negatif 0.081

BB Litvet 2 Positif 1.427

Negatif 0.073

Keterangan. BB Litvet : Balai Besar Penelitian Veteriner

Penentuan nilai cut off ELISA paratuberkulosis dengan menggunakan antigen protoplasmik MAP isolat lapang dalam penelitian ini dilakukan dengan menguji 400 serum negatif paratuberkulosis, dan dihitung dengan rumus rataan OD negatif + 2SD, kemudian dikonversi ke dalam S/P rasio (OD sampel terkoreksi/OD kontrol positif terkoreksi). Hasil perhitungannya adalah positif jika nilai S/P rasio lebih dari 0.6 dan negatif jika nilai S/P rasio sama dengan atau kurang dari 0.6. Serum sapi yang diuji berjumlah 322 sampel, yaitu 300 negatif paratuberkulosis (kultur feses negatif) dan 22 positif paratuberkulosis (kultur feses positif). Hasil ELISA dengan menggunakan PPA-L (ELISA PPA-L) untuk serum tersebut menunjukkan sensitivitas dan spesifitasnya masing-masing 68.18% dan 97.0% (Tabel 4). Koefisen variasi untuk kontrol positif 6.4% dan kontrol negatif 7.8% .

Tabel 5 Hasil ELISA dengan menggunakan antigen protoplasmik MAP isolat lapang (ELISA PPA-L) dengan sampel 22 positif dan 300 negatif paratuberkulosis

ELISA Serum

Positif Negatif Total

Positif 15 9 24

Negatif 7 291 298

Total 22 300 322

Keterangan. ELISA: enzym-linked immunosorbent assay; PPA-L: antigen protoplasmik MAP isolat lapang

27 Untuk pengujian paratuberkulosis dalam rangka pemantauan dan pengendalian penyakit pada peternakan sapi, ELISA merupakan metode yang paling banyak digunakan, karena murah, cepat, dan mempunyai spesifitas yang tinggi. Walaupun variatif, metode ELISA mempunyai sensitivitas yang lebih tinggi dibandingkan uji serologi lain (Reichel et al.1999; Stabel et al. 2002). Sensitivitas metode ELISA akan meningkat seiring dengan perjalanan penyakit dan tingginya jumlah bakteri yang dikeluarkan melalui feses (Roussel et al., 2007).

Penggunaan PPA dari isolat Mycobacterium lain atau strain MAP yang berbeda akan menyebabkan terjadinya variasi hasil dalam deteksi antibodi paratuberkulosis, terutama sensitivitas dan spesifitasnya. Menurut Nielsen et al. (2001) antigen PPA dari Mycobacterium strain 18 mempunyai sensitivitas yang lebih tinggi dibandingkan dari MAP strain 316, yaitu masing-masing 58.4% dan 47.3%, namun memiliki nilai spesifitas yang lebih rendah, yaitu 94.5% dan 99.0%. Marrasi et al. (2005) menyatakan bahwa sensitivitas dan spesifitas uji ELISA dengan PPA dari isolat Mycobacterium avium (M. avium) masing-masing 76.9% dan 70.0%. Adji (2008) melaporkan bahwa ELISA paratuberkulosis dengan kit LSIVet cofirmation test yang menggunakan antigen PPA M. avium serovar 2, sensitivitasnya 25.0% dengan spesifitas 96.8%. Untuk meminimalkan atau menghilangkan reaksi silang dengan Mycobacterium lain, serum sebaiknya diabsorbsi terlebih dahulu dengan antigen M. phlei (Shin et al. 2008; Yokomizo et al.1985). Menurut McKenna et al. (2005), bahwa ELISA dengan mengabsorbsi serum terlebih dahulu dengan antigen M. phlei (absorbed ELISA) akan meningkatkan spesifitasnya, yaitu 98.4%, sedangkan yang tidak diabsorbsi spesifitasnya hanya mencapai 87.9%.

Untuk mengevaluasi hasil uji ELISA PPA-L, sampel serum yang sama juga diuji dengan kit ELISA komersial IDEXX paratuberkulosis screening antibody test (IDEXX Laboratories, USA) yang menggunakan antigen PPA dari MAP strain 316. Hasil uji menunjukkan bahwa sensitivitas dan spesifitas dengan kit tersebut masing-masing 63.64% dan 97.33% (Tabel 6). Sensitivitas dan spesifitas uji ELISA PPA-L dan kit komersial dapat dilihat pada Tabel 7.

Tabel 6 Hasil ELISA kit komersail IDEXX paratuberculosis screening antibody test dengan sampel 22 positif dan 300 negatif paratuberkulosis

ELISA Serum

Positif Negatif Total

Positif 14 8 22

Negatif 8 292 300

Total 22 300 322

Keterangan. ELISA: enzym-linked immunosorbent assay; IDEXX: produsen kit ELISA komersial paratuberculosis screening antibody test

Tabel 7 Sensitivitas dan spesifitas uji ELISA PPA-L dan kit komersial (IDEXX)

ELISA Hasil

Sensitifitas Spesifitas

PPA-L 68.18% 97.0%

IDEXX 63.64% 97.33%

Keterangan. ELISA: enzym-linked immunosorbent assay; PPA-L: antigen protoplasmik MAP isolat lapang; IDEXX: produsen kit ELISA komersial paratuberculosis screening antibody test

Hasil tersebut di atas menunjukkan bahwa penggunaan antigen protoplasmik MAP isolat lapang untuk uji ELISA memberikan sensitivitas yang lebih tinggi dengan spesifitas yang sedikit lebih rendah dibandingkan dengan kit komersial IDEXX. Sensitivitas yang lebih tinggi ini kemungkinan juga disebabkan adanya perbedaan komponen protein yang ada dalam PPA MAP isolat lapang dengan PPA dari MAP strain lain. Walaupun studi tentang antigen lain telah dilakukan, seperti pengunaan secreted antigen untuk uji ELISA yang mempunyai sensitivitas 74.0% dan spesifitas 99.0%, maupun antigen ekstrak etanol yang mempunyai sensitivitas 97.1% dan spesifitas 100.0% (Scott et al. 2010; Shin et al. 2008). Namun sampai saat ini PPA tetap menjadi pilihan utama untuk uji serologi paratuberkulosis, karena didalamnya terdapat protein 34 kDa yang bersifat imunodominan dan mempunyai B-cell epitopes yang spesifik terhadap antibodi MAP (Malamo et al. 2006; Ostrowski et al. 2003; Vannuffel et al. 1994). Selain itu, PPA lebih mudah diproduksi dalam jumlah yang lebih banyak. Uji ELISA paratuberkulosis dengan antigen protoplasmik MAP isolat lapang dapat digunakan untuk pengujian serologi paratuberkulosis dengan sensitivitas dan spesifitas yang tidak kalah dengan kit komersial.

SIMPULAN

Antigen protoplasmik Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis isolat lapang (PPA-L) dapat digunakan untuk pengembangan uji paratuberkulosis. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) dengan menggunakan antigen protoplasmik MAP isolat lapang mempunyai kemampuan yang baik dan lebih ekonomis untuk uji serologi paratuberkulosis serta dapat digunakan untuk uji tapis terhadap penyakit tersebut di Indonesia.

5 PEMBAHASAN UMUM

Paratuberkulosis pada Sapi Di Indonesia

Sapi perah merupakan salah satu ternak yang relatif banyak dipelihara untuk memproduksi susu. Populasi sapi perah di Indonesia sampai saat ini kurang lebih 611,939 ekor, sedangkan untuk sapi potong mencapai 15,980,697. Sapi perah yang ada di Indonesia sebagian besar berjenis Friesian Holstein (FH) dan diimpor dari luar negeri, terutama dari Eropa, Australia dan New Zealand (Ditjen PKH 2013). Selain itu, untuk memenuhi kebutuhan ternak bibit dan adanya program swasembada daging, dilakukan importasi ternak dengan jumlah yang besar dari Australia. Hal ini perlu diperhatikan karena Australia merupakan negara endemis paratuberkulosis dengan prevalensi 17%, ini dapat meningkatkan resiko bertambahnya kasus paratuberkulosis di Indonesia.

Di Indonesia, tatacara peternakan sapi rakyat masih dilakukan semiintensif dengan pengelolaan lingkungan yang masih kurang memperhatikan sanitasi yang benar. Ini akan mempermudah penularan dan penyebaran penyakit, jika paratuberkulosis menginfeksi peternakan tersebut. Selain itu, sistem pemerahan dan penanganan susu yang kurang baik dan higienis akan meningkatkan resiko terkontaminasi MAP. Hal ini dapat berdampak pada kesehatan masyarakat, karena paratuberkulosis merupakan zoonosis potensial. Paratuberkulosis masih asing bagi peternak rakyat, sehingga mereka kurang mempunyai perhatian dan cenderung membiarkan jika terdapat gejala yang mungkin diakibatkan oleh penyakit ini, seperti penurunan produksi susy, penurunan berat badan, dan diare.

Kejadian kasus paratuberkulosis di Indonesia pertama kali dilaporkan pada tahun 1958 oleh Lembaga Pusat Penjakit Hewan (LPPH) atau sekarang Balai Besar Penelitian Veteriner (BB Litvet) pada sapi perah di daerah Bogor. Ini dibuktikan dengan adanya gambaran patologi anatomi usus yang mengalami enteritis granulomatosa (usus dalam pengawet formalin masih tersimpan di BB Litvet). Penyakit ini secara serologi pernah dilaporkan oleh Balai Penyidikan Penyakit Hewan (BPPH) atau sekarang Balai Veteriner Medan pada tahun 1985 (Setyowati et al. 1986). Studi yang dilakukan Adji (2004), menunjukkan bahwa seroprevalensi paratuberkulosis pada sapi perah di Jawa Barat berkisar 1,67%. Penyakit ini pada sapi perah secara definitif dilaporkan tahun 2008, selain adanya seropositif yang terus bertambah, juga dapat diisolasi dan teridentifikasi Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) dari Jawa Barat dan Jawa Tengah, yang telah dikonfirmasi dengan sifat ketergantungan terhadap mycobactine dan dengan metode polymerase chain reaction (PCR) yang menggunakan primers IS900 dan F57 (Adji 2008).

Adanya laporan kasus paratuberkulosis tersebut di atas, dan untuk meminimalkan ancaman penyakit terutama dari ternak impor, berdasarkan Keputusan Menteri Pertanian nomor 3238/Kpts/PD.630/9/2009, maka penyakit ini dimasukkan ke dalam hama penyakit hewan karantina (HPHK) golongan 2 dan diwajibkan melakukan pengujian paratuberkulosis untuk ternak bibit impor sapi, kambing, domba, rusa, semen, dan embrio. Namun untuk pemantauan paratuberkulosis di peternakan sapi perah atau pembibitan, sampai saat ini belum dilakukan dengan baik, sehingga epidemiologi kasus paratuberkulosis pada sapi di wilayah Indonesia belum dilaporkan secara menyeluruh. Hal ini karena

mahalnya reagen atau media untuk diagnosis dan sulitnya melakukan isolasi dan identifikasi MAP. Selain itu, tidak semua laboratorium kesehatan hewan yang ada di Indonesia mempunyai kemampuan untuk melakukan pengujian.

Untuk mengatasi masalah tersebut, paratuberkulosis kemudian dimasukkan ke dalam daftar penyakit hewan menular strategis (PHMS), sesuai dengan Keputusan Menteri Pertanian nomor 4026/Kpts/OT.140/3/2013. Harapanya dapat digunakan sebagai dasar hukum untuk penetapan anggaran pemantauan dan pengendalian penyakit. Berdasarkan peraturan di atas, pengadaan reagen diagnosis dan peningkatan kemampuan laboratorium untuk pemeriksaan paratuberkulosis terus dilakukan, baik secara serologi, molekuler dengan PCR maupun isolasi dan identifikasi MAP.

Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis Ditinjau dari Aspek Kesehatan Masyarakat Veteriner

Paratuberkulosis dilaporkan bersifat zoonosis potensial, karena bakteri MAP dilaporkan juga dapat menginfeksi manusia dan lebih dikenal dengan sebutan Crohn’s disease (CD), namun sampai saat ini penyebab CD masih

menjadi perdebatan. Crohn’s disease merupakan penyakit peradangan non-spesifik kronis pada manusia yang terjadi pada ileum bagian bawah sampai

dengan kolon. Penyakit ini ditemukan pertama kali oleh Dalziel pada tahun 1913 di Western Infirmary, Glasgow. Pemberian nama CD setelah Crohn, Ginzburg, dan Oppenheimer mendeskripsikan 8 kasus radang ileum pada tahun 1932 di rumah sakit Mount Sinai, New York (SCAHAW 2000). Penyebab CD sampai saat ini masih belum diketahui dengan pasti, yaitu teori auotimun (immune dysregulation theory), teori defisiensi kekebalan (immune deficiency theory), dan teori mycobacterial (Mycobacterial theory) (Chamberlin dan Naser 2006; Alluwaimi 2007)

MAP diduga kuat sebagai penyebab CD terlihat pada tahun 1913 setelah Dalziel menemukan perubahan patologi usus pada kasus CD yang menunjukkan adanya peradangan granulomatosa, yang hampir sama dengan gambaran patologi usus sapi yang menderita Johne’s disease (JD), tetapi saat itu Dalziel belum berhasil mengisolasi bakteri tahan asam. Pada awalnya penyakit ini hanya terjadi pada ileum, tetapi pada tahun 1960 Lockart-Mummery dan Morson berhasil mengidentifikasi adanya radang pada kolon yang membentuk granuloma, karena peradangan yang semakin luas sehingga disebut sebagai chronic inflamatory bowels disease (IBD) (SCAHAW 2000).

Data yang menguatkan MAP sebagai penyebab CD, yaitu dapat diisolasinya bakteri ini dari darah pasien IBD 43% (14/28 CD dan 2/9 ulcerative colitis(UC)) serta tidak ditemukan pada 11 pasien non-IBD. Selain itu, bakteri ini juga dapat diisolasi dari susu pasien CD (Naser et al. 2000a; Naser et al. 2004). Isolasi MAP dengan hasil positif dari sampel feses dan biopsi jaringan pasien CD juga dibuktikan oleh Singh et al. (2007). Penggunaan antigen spesifik MAP juga dapat digunakan untuk mendeteksi adanya antibodi MAP pada pasien penderita CD (Naser el al. 2000b; Shin et al. 2009). Bukti lain yang menguatkan adalah dapat terdeteksinya material genetik MAP dari pasien CD dengan menggunakan metode polymerase chain reaction (PCR) (Bull et al. 2003; Dell’Isola et al. 1994). Berdasarkan data-data dan adanya kemiripan perubahan patologi usus penderita CD pada manusia dengan JD pada sapi menimbulkan dugaan kuat potensi

31 penularan MAP dari hewan ke manusia (zoonosis). Penularan ke manusia kemungkinan besar melalui susu sapi dan produk olahannya, karena bakteri MAP relatif tahan terhadap pasteurisasi (SCAHAW 2000).

Hewan yang menderita paratuberkulosis baik klinis maupun subklinis dapat mengeluarkan bakteri melalui susunya. Bakteri MAP pada susu dilaporkan pertama kali tahun 1935 dari kasus klinis paratuberkulosis pada sapi. Persentase MAP yang dapat diisolasi dari susu sangat bervariasi sesuai dengan kasus penyakit. Pada kasus paratuberkulosis klinis, MAP yang dapat diisolasi dari susu lebih dari 45.0%, sedangkan dari kolostrum lebih dari 22.0%. Untuk kasus subklinis, MAP yang dapat diisolasi dari susu adalah kurang lebih 19.0 % pada kondisi heavy shedder dan untuk kasus subklinis yang intermediate dan light shedder MAP yang dapat diisolasi dari susu antara 5.0-8.0% (Pinedo et al. 2008). Keberadaan bakteri ini pada susu dapat disebabkan oleh kontaminasi feses sapi penderita ataupun shedding langsung ke dalam susu yang mekanisme secara pasti belum diketahui, kemungkinan melalui peredaran darah atau sistem limfatik (supramamary lymp node) (Sweeney et al. 1992).

Menurut penelitian yang dilakukan oleh Giese dan Ahrens (2000), prosentase hasil kultur dan PCR untuk susu segar individual masing-masing 45.0% dan 18.0%, dengan estimasi jumlah MAP yang terdapat dalam susu kurang dari 100 CFU/ml, sedangkan Ayele et al. (2005) dapat mengisolasi 18.4% dengan estimasi jumlah MAP 4-20 CFU/50 ml susu. Untuk di tempat pengumpulan susu, baik di peternakan atau industri, MAP yang terdeteksi dengan kultur dan PCR masing-masing 5.0% dan 50.0% (Pillai dan Jayarao 2002), 1.6% dan 7.8% (Grant et al. 2002). Bakteri MAP dilaporkan masih dapat bertahan dalam susu yang sudah dipasteurisasi secara komersial. Menurut laporan Grant et al. (2002), bahwa dengan metode PCR dan kultur, prosentase MAP dalam susu pasteurisasi adalah 11.8% dan 1.8%, sedangkan studi Ellingson et al. (2005) adalah 64.0% dan 2.8%.

Produk olahan susu seperti keju dan susu formula bayi juga mempunyai resiko sebagai media penularan MAP ke manusia. Berdasarkan penelitian menunjukkan bahwa bakteri MAP dapat diisolasi dari keju, yaitu Greek feta cheese 4.7% dan hard atau semihard cheese 2.4% (Ikonomopolous et al. 2005). Untuk produk susu yang lain seperti susu formula bayi, MAP juga dapat diisolasi dengan estimasi 2.0% (Hruska et al. 2005). Hasil PCR positif MAP pada susu formula lanjutan juga pernah dilaporkan terjadi di Bogor (Nugroho 2008). Beberapa negara yang telah melaporkan prevalensi keberadaan MAP dalam susu segar, adalah Argentina 8.3%, Republik Czechna 2.0%, Irlandia 0.3%, Inggris 6.9%, Amerika Serikat 0-28.6%, dan India 44.0%. Laporan prevalensi keberadaan MAP pada susu pasteurisasi komersial di Amerika Serikat mencapai 2.8%, Irlandia Utara 6.9%, Republik Czechna 1.6%, dan India 67.0%. Adanya MAP dalam produk susu juga telah dilaporkan oleh beberapa negara, di Yunani mencapai 50.0%, Republik Czechna 20.0%, Swiss 4.0%, Amerika Serikat 23.0%, dan India 56.0% (Slana et al. 2008; Singh et al. 2010).

Laporan tentang dapat diisolasinya MAP dari produk olahan susu

Dalam dokumen Pengembangan Media Kultur dan Pemanfaatan Antigen Protoplasmik Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis Isolat Lapang untuk Diagnosis Paratuberkulosis (Halaman 40-56)