METODE PENELITIAN
Penelitian ini dirancang untuk melihat efek penambahan kitosan nano dari blangkas pada SIKMR dan SIKMRn terhadap mikrostruktur dentin dan komposisi kimia dari kombinasi kedua bahan tersebut. Pada penelitian ini ditetapkan empat kelompok perlakuan yang masing-masing adalah gigi premolar dipapari dengan bahan SIKMR dan SIKMRn tanpa penambahan kitosan nano blangkas serta SIKMR dan SIKMRn yang telah ditambahkan kitosan nano dari blangkas, kemudian dilakukan pemeriksaan secara kualitatif dengan menggunakan SEM dan kuantitatif dengan menggunakan EDX.
3.1 Desain Penelitian
Rancangan Penelitian : Post Test Only Group Design. Jenis Penelitian : Eksperimental laboratorium.
3.2 Tempat dan Waktu
Tempat: 1. Departemen Konservasi Fakultas Kedokteran Gigi USU 2. Laboratorium pusat penelitian FMIPA USU
3. Laboratorium Departemen Mineral Fakultas Science Bahan dan Mineral University of Sains Malaysia, Nibong Tebal Penang, Malaysia
3.3 Sampel dan Besar Sampel Penelitian 3.3.1 Sampel Penelitian
Sampel pada penelitian ini adalah gigi premolar bawah yang tidak memiliki karies dan akan diekstraksi untuk kebutuhan ortodonti kemudian dilakukan preparasi kavitas klas satu serta diaplikasikan bahan coba SIKMR, SIKMRn, SIKMR dan SIKMRn yang ditambahkan kitosan nano blangkas.
Penelitian eksperimen dengan rancangan acak kelompok, berdasarkan jumlah minimal yang ditetapkan rumus Federer (1955), secara sederhana dirumuskan:
(t-1) (n-1) ≥ 15. .(4-1) (n-1)≥ 15n ≥6 ….
Keterangan : t = banyaknya kelompok perlakuan n = jumlah spesimen.
Besar sampel yang dipakai pada setiap kelompok perlakuan pada penelitian ini digenapkan menjadi enam sampel per kelompok. Penentuan persen berat kitosan pada penelitian ini didasarkan pada penelitian sebelumnya, dimana menggunakan SIK nano modifikasi kitosan bermolekul tinggi dan menggunakan kitosan dengan berat yang memberikan efek yang terlihat secara statistik, yaitu 0,015% berat.
Penelitian ini membagi kelompok perlakuan menjadi enam kelompok: 1. Kelompok I : 6 sampel gigi yang diaplikasikan SIKMR.
2. Kelompok II : 6 sampel gigi yang diaplikasikan SIKMRn.
3. Kelompok III :6 sampel gigi yang diaplikasikan modifikasi SIKMR dan kitosan nano dari blangkas sebanyak 0,015% berat.
4. Kelompok IV : 6 sampel gigi yang diaplikasikan modifikasi SIKMRn dan kitosan nano dari blangkas sebanyak 0,015% berat.
3.4 Variabel dan Defenisi Operasional 3.4.1 Variabel Penelitian
Varian SIK berupa:
3.4.1.1 Variabel Bebas
1. SIKMR. 2. SIKMRn.
3.Modifikasi SIKMR ditambahkan kitosan nano dari blangkas dengan 0,015% berat.
4.Modifikasi SIKMRn ditambahkan kitosan nano dari blangkas dengan 0,015% berat.
- Komposisi kimia
3.4.1.2 Variabel Terikat
- Mikrostruktur
1. Sterilisasi alat dan bahan coba
3.4.1.3 Variabel Terkendali
2. Sampel gigi yang digunakan Gigi Premolar bawah 3. Perendaman gigi dalam saline sebelum dimulai perlakuan 4. Proses pembuatan kitosan blangkas
5. Ukuran preparasi sampel
6. Cara pengadukan (satu operator)
7. Jarak light cure ke permukaan bahan restorasi 8. Waktu pengadukan
9. Waktu pengerasan
10. Perbandingan berat kitosan dan SIKMR serta SIKMRn 11. Cara pencampuran SIKMR dan SIKMRn dengan kitosan 12. Penyimpanan sampel
1. Lama penyimpanan kitosan blangkas
3.4.1.4 Variabel Tidak Terkendali
2. Jangka waktu pencabutan gigi premolar mandibular sampai perlakuan 3. Hybrid layer yang terbentuk antara bahan restorasi dengan dentin 4. Kelembapan udara pada saat penyimpanan bahan uji.
3.4.2 Definisi Operasional
Definisi operasional, cara ukur, hasil ukur, dan alat ukur dari masing-masing variabel penelitian dapat dijelaskan pada Tabel 3.1
Tabel 3.1.DEFINISI OPERASIONAL, CARA, HASIL, DAN ALAT UKUR DARI VARIABEL BEBAS DAN TERGANTUNG DARI PENELITIAN
No. Variabel Definisi Operasional Cara
Ukur
Hasil
Ukur Alat Ukur
1. Variabel bebas a. SIKMR b. SIKMR + kitosan nano dari blangkas c. SIKMRn
Jenis SIK yang dimodifi- kasi resin pada likuidnya dengan 2-
hydroxyethylmethacrylate (HEMA).(Vitrebond) Jenis SIK yang dimodifi- kasi resin pada likuidnya dengan 2-
hydroxyethylmethacrylate (HEMA) dan ditambah- kan dengan kitosan nano dari blangkas.
Jenis SIK modifikasi re- sin dengan ukuran parti- kel kaca nano (Ketac TM N100).Pengadukan pasta yang keluar dari dispense sebanyak 2 klik selama 20 detik, kemudian pe- ngerasan dilakukan de- ngan penggunaan light cured selama 20 detik.
Sesuai aturan pabrik Sesuai aturan pabrik Dua klik pasta SIKMRn Nominal Nominal Nominal 1 sendok bubuk dan 1tetes likuid
1 sendok bubuk dan 1.tetes likuid
Perbandingan pasta 1 dan pasta 2 = 1:1 2. d. SIKMRn + kitosan nanodari blangkas Variabel ter- gantung a. Komposisi kimia SIKMRn ditambahkan dengan kitosan nano dari blangkas.Pengadukan pasta yang keluar dari dispense sebanyak 2 klik dengan penambahan gel kitosan nano sekaligus selama 20 detik, kemudi- an pengerasan dilakukan dengan penggunaan light cured selama 20 detik.
Unsur-unsur kimia yang terdapat dalam kombinasi SIKMR maupun SIKMRn yang ditambahkan kitosan Sesuai aturan pabrik wt % SIKMRn+ kitosan nano 0,015% berat Numerik Perbandingan pasta 1 dan pasta 2 = 1:1
Energy Dispersive X-ray
b. Mikrostruk- tur
blangkas nanopartikel Gambaran mikrostruktur pada kombinasi SIKMR maupun SIKMRn yang ditambahkan kitosan blangkas nanopartikel terhadap gigi berupa adaptasi marginal dan morfologi permukaan.
Sesuai SOP alat
- Scanning Electron Microscope (SEM)
3.5 Alat dan Bahan Penelitian 3.5.1 Alat penelitian
1. Masker dan sarung tangan 2. Wadah kaca tertutup 3. Gelas ukur (Pyrex®
4. Labu ukur ( Pyrex
, USA)
®
5. Jar Test (Aztec)
, USA)
6. Neraca analitik (Sartorius, Germany) untuk menimbang berat SIKMR dan SIKMRn dengan berat kitosan nano
7. Neraca elektrik (Chyo Balance, Japan) untuk menimbang serbuk kitosan yang akan dibuat menjadi kitosan nano dalam bentuk pasta
8. Kamera digital 9. Pinset
10. Spatula plastik 11. Instrumen plastis 12. Light curing
13. Lempengan kaca
14. Ultrasonic Bath (Kerry Fulsatron, Sonic, USA) 15. Kertas saring (Whatman®
16.Low speed micromotor bur dan semprotan air
, USA)
17.Tungsten carbide bur jenis round
18.Diamond bur berbentuk cakram
19.Scanning Electrone Microscope (SEM)
20.Energy Dispersive X-ray Spectrophotometry(EDX)
3.5.2 Bahan penelitian
Pada penelitian ini digunakan jenis SIK yang banyak digunakan oleh dokter gigi di Indonesia, yaitu Resin Modified Glass Ionomer Cement (Vitrebond 3M ESPE) dan Nano-ionomer restorative (Ketac N100 light cured) (Gambar 3.1). Bahan penelitian yang juga digunakan adalah :
1. Serbuk kitosan blangkas (Gambar 3.2) 2. Asam asetat 1%
3. Amoniak 4. Aqudest 5. Dental stone
6. Alumina suspension polishΦ 1 μ
7. Kertas pasir grit 2000
9. Spuit 3 cc
(a) (b)
Gambar 3.1. Bahan Penelitian yang akan Digunakan. (a).Vitrebond (3M ESPE, USA); (b).
Ketac™ N100 (3M ESPE USA)
Gambar 3.2. Serbuk Kitosan Blangkas (Laboratorium Penelitian FMIPA USU, Medan)
3.6 Prosedur Penelitian
3.6.1 Pembuatan Pasta Kitosan
Kitosan Pasta dibuat dengan melarutkan 1 gram kitosan dalam 50 ml larutan asam lemah (asam asetat 1%) lalu di aduk pada kecepatan 200 rpm sehingga diperoleh gel selama ± 30 menit. Kemudian larutan kitosan ditetesi dengan larutan amoniak sebanyak 20 tetes sambil diaduk (Szeto dan Zhigang Hu cit. Siregar M,
2009). Campuran larutan kitosan dengan larutan amoniak diaduk kembali dengan pengaduk selama ± 30 menit. Penambahan amoniak dilakukan agar permukaan larutan halus. Larutan yang telah membentuk pasta tersebut dimasukkan ke dalam
Ultrasonicbath untuk memecahkan partikel kitosan tersebut menjadi nano (Gambar 3.3). Selanjutnya disaring dan residunya dicuci dengan aquadest untuk menghilangkan bau amoniak. Hasil residu yang berbentuk pasta kitosan nano inilah yang akan ditambahkan ke dalam SIKMR dan SIKMRn (Gambar 3.4).
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
Gambar 3.3. Proses Pembuatan Pasta Kitosan. (a).Penambahan 50 ml larutan asam lemah
(asam asetat1%) pada1 gram kitosan blangkas; (b).Mixing speed dengan
kecepatan 200 rpm; (c). Pengadukan bahan ± 30 menit; (d).Penambahan
larutan amoniak sebanyak 20 tetes; (e).Dimasukkan dalam ultrasonic bath
untuk memecahkan partikel kitosan menjadi nanopartikel; (f).Penyaringan kitosan dan pencucian residu dengan aquadest
Gambar 3.4. Pasta Kitosan Nano dari Blangkas yang Siap Dipakai
3.6.2 Persiapan Sampel
Gigi premolar diukur dan ditandai dari cemento-enamel junction kearah koronal untuk menentukan luas preparasi kavitas (Gambar 3.5). Preparasi kavitas klas I dilakukan pada masing-masing gigi dan diaplikasikan bahan uji (Gambar 3.6). Gigi dibagi dua dengan menggunakan bur cakram dan semprotan air pada arah bukal dan lingual kemudian akar gigi dipotong. Bagian mahkota gigi yang sudah dibagi dua ditanam dalam mould spuit yang berisi dental stone dengan diameter 5 mm dan tinggi 3 mm. Setelah cetakan mengeras, cetakan dikeluarkan dari mould (Gambar 3.7).
(a) (b)
(c)
Gambar 3.6. Proses persiapan sampel. (a). Pengukuran luas preparasi kavitas; (b). Hasil preparasi kavitas Klas I; (c). Aplikasi bahan uji
(a) (b)
Gambar 3.7. Pemotongan sampel. (a). Preparasi sampel dengan menggunakan bur cakram; (b). Sampel ditanam menggunakan dental stone
3.6.3 Pembuatan Bahan Uji
Bahan uji dibuat dengan mengaduk pasta SIKMR sebanyak 0.44 gram dan pasta SIKMRn sebanyak 2 klik (0,44 gram). Kemudian pasta SIKMR ditambahkan kitosan nano sebanyak 0,015% berat. Pasta SIKMRn ditambahkan kitosan nano sebanyak 0,015% berat. Pengukuran berat pasta SIKMR dan SIKRMn dengan kitosan nano menggunakan neraca analitik empat digit (Gambar 3.8).
Pengadukan bahan uji ini mengunakan spatula plastik dilakukan selama ± 20 detik hingga membentuk campuran homogen, kemudian pasta diaplikasikan ke dentin dan sinari dengan light cure selama 20 detik.
Gambar 3.8. Neraca Analitik
3.6.4 Perlakuan dan Pengujian Sampel
Sampel diberi nomor 1 s/d 24 dan dibagi secara acak menjadi 4 kelompok sehingga setiap kelompok terdiri dari 6 sampel. Perlakuan untuk setiap kelompok adalah sebagai berikut:
1. Kelompok I : 6 sampel gigi yang diaplikasikan SIKMR. 2. Kelompok II : 6 sampel gigi yang diaplikasikan SIKMRn.
3. Kelompok III : 6 sampel gigi yang diaplikasikan modifikasi SIKMR dan kitosan nano dari blangkas sebanyak 0,015% berat.
4. Kelompok IV : 6 sampel gigi yang diaplikasikan modifikasi SIKMRn dan kitosan nano dari blangkas sebanyak 0,015% berat.
Setelah pengaplikasian bahan uji, dilakukan pengujian sampel dengan alat EDX dan SEM (Gambar 3.9). Pengujian sampel dengan EDX bertujuan untuk mengetahui komposisi kimia setiap kelompok. Sedangkan pemeriksaan SEM bertujuan untuk mendapatkan gambaran mikrostruktur sampel (Gambar 3.10 dan 3.11).
3.6.5 Prosedur Pengujian Sampel dengan EDX
Prosedur pengujian sampel dengan EDX adalah sebagai berikut: 1. Ditentukan daerah yang akan dianalisa.
2. Pengambilan data dilakukan dengan pemindaian oleh scanner pada alat EDX dan data akan diperoleh dalam waktu 1 detik.
3. Hasil yang diperoleh dapat dilihat pada layar EDX.
4. Jenis dan jumlah elemen yang terdapat pada daerah pemindaian akan dikonfirmasi dengan menggunakan software.
3.6.6 Prosedur Pengujian dengan SEM
Prosedur pengujian dengan SEM adalah sebagai berikut:
1. Dari masing-masing kelompok ditentukan 1 buah sampel untuk dilakukan pengambilan gambar mikrostruktur.
2. Sampel dilapisi (coating) dengan cairan emas dengan ketebalan (5-20 nm). 3. Sampel diletakkan pada chamber yang vakum dan berada tepat ditengah-tengah
chamber. Ketinggian sampel harus sesuai dengan kalibrasi standard. 4. Kemudian alat dihidupkan dengan daya 20 kV.
5. Sampel digeser secara perlahan untuk mendapatkan daerah yang akan difoto pada layar SEM.
6. Brightness, contrast dan focus disesuaikan sampai didapatkan gambaran yang baik.
(a) (b)
Gambar 3.10. Mesin coating. (a). Mesin coating untuk persiapan sampel; (b). Sampel yang
akan dicoating
(a) (b)
(c) (d)
Gambar 3.11. (a). Sampel yang telah siap dicoating; (b).Peletakan sampel pada piringan; (c). Sampel yang akan dilihat melalui SEM; (d). Hasil SEM dan EDX dibaca melalui layar monitor.
3.7 Analisis Statistik
Data yang diperoleh dilakukan uji statistik analisa varians satu arah (ANOVA) dengan tingkat kemaknaan (α = 0,05) untuk mengetahui perbedaan komposisi kimia pada kelompok I,II,III, dan IV. Selanjutnya dilakukan uji LSD (Least Significancy Different) untuk mengetahui perbedaan komposisi kimia diantara kelompok perlakuan.