METODE METODE
METODE PENELITIANPENELITIANPENELITIANPENELITIAN
Metode penelitian yang dilakukan adalah metode eksperimental. Tahap penelitian meliputi penyiapan bahan, karakterisasi simplisia, uji golongan senyawa kimia dan pembuatan ekstrak. Selanjutnya pengujian aktivitas antijamur dengan metode difusi agar menggunakan silinder logam. Parameter yang dilihat adalah besarnya diameter hambat pertumbuhan jamur. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fitokimia dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
3.1 3.1
3.13.1 AlatAlatAlatAlat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, oven, tanur, rotary evaporator, krus porselin, desikator, inkubator, autoklaf, kompor gas, penangas air, jangka sorong, blender, jarum ose, kertas saring, lemari pendingin, mikroskop, neraca listrik, penangas air, pencadang logam (diameter 6 mm), pinset, Laminar air flow cabinet,pipet mikro, pinset, seperangkat alat penetapan kadar air dan kamera digital.
3.2 3.2
3.23.2 BahanBahanBahanBahan
Bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah teripang bilalo,
potato dextrose agar, jamur Candida albicans ATCC No. 10231 yang diperoleh dari laboratorium mikrobologi fakultas farmasi USU, natrium klorida, air suling, bahan kimia yang digunakan berkualitas pro analisa, yaitu: etanol,
etil asetat, n- heksan, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, eter, kalium iodida, iodium, bismut (III) nitrat, asam asetat, asam asetat anhidrida, raksa (II) klorida, kloroform, kloralhidrat dan toluena.
3333.3.3.3.3 PenyiapanPenyiapanPenyiapanPenyiapan SampelSampelSampelSampel 3333.3.1.3.1.3.1.3.1 PengumpulanPengumpulanPengumpulanPengumpulan sampelsampelsampelsampel
Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membanding kan dengan daerah lain. Sampel yang digunakan adalah teripang yang masih segar dari perairan Sabang, Aceh.
3333.3.2.3.2.3.2.3.2 IdentifikasiIdentifikasiIdentifikasiIdentifikasi sampelsampelsampelsampel
Identifikasi sampel dilakukan di Pusat Penelitian Oseanografi LIPI Jakarta.
3333.3.3.3.3.3.3.3.3 PengolahanPengolahanPengolahanPengolahan sampelsampelsampelsampel
Teripang dibersihkan dari kotoran dengan cara mencuci di bawah air mengalir hingga bersih, kemudian dipisahkan dari bagian dalam perut dan di perkecil potongannya selanjutnya ditiriskan lalu ditimbang kemudian disebar diatas wadah. Sampel dikeringkan dengan cara diangin-anginkan diudara terbuka. Kemudian dikeringkan di lemari pengering. Teripang yang sudah kering ini disebut simplisia hewan. Kemudian simplisia diblender sampai menjadi serbuk, ditimbang beratnya. Selanjutnya simplisia disimpan dalam wadah plastik dan disimpan di tempat yang terlindung dari cahaya.
3.4 3.4
3.43.4 PembuatanPembuatanPembuatanPembuatan PereaksiPereaksiPereaksiPereaksi
Pembuatan larutan pereaksi asam klorida 2 N, asam sulfat 2 N, Mayer, Bouchardat, kloralhidrat (Depkes RI, 1995), Liebermann-Burchard dan Dragendorff (Harborne, 1987).
3333.4.1.4.1.4.1.4.1 PereaksiPereaksiPereaksiPereaksi aaaasamsamsamsam kkkkloridaloridaloridalorida 2222 NNNN
Sebanyak 16,67 ml asam klorida pekat dilarutkan dalam air suling hingga volume 100 ml.
3333.4.2.4.2.4.2.4.2 PereaksiPereaksiPereaksiPereaksi aaaasamsamsamsam ssssulfatulfatulfatulfat 2222 NNNN
Sebanyak 5,4 ml asam sulfat pekat dilarutkan dalam air suling hingga volume 100 ml.
3333.4.3.4.3.4.3.4.3 PereaksiPereaksiPereaksiPereaksi MayerMayerMayerMayer
Sebanyak 1,35 g raksa (II) klorida dilarutkan dalam 60 ml air suling. Kemudian pada wadah lain sebanyak 5 g kalium iodida dilarutkan dalam 10 ml air lalu campurkan keduanya dan ditambahkan air suling hingga 100 ml.
3.4.4 3.4.4
3.4.43.4.4 PereaksiPereaksiPereaksiPereaksi BouchardatBouchardatBouchardatBouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida, dilarutkan dalam sedikit air suling kemudian ditambahkan 2 g iodium, setelah semuanya larut ditambahkan air suling hingga 100 ml.
3333.4.5.4.5.4.5.4.5 PereaksiPereaksiPereaksiPereaksi DragendorffDragendorffDragendorffDragendorff
Sebanyak 0,85 g bismut (III) nitrat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 100 ml asam asetat glasial ditambahkan 40 ml air suling. Kemudian pada wadah lain ditimbang 8 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 20 ml air
suling, lalu campurkan kedua larutan sama banyak. Kemudian ditambahkan 20 ml asam asetat glasial dan diencerkan dengan air suling hingga 100 ml.
3333.4.6.4.6.4.6.4.6 PereaksiPereaksiPereaksiPereaksi KloralhidratKloralhidratKloralhidratKloralhidrat
Sebanyak 70 g kloralhidrat dilarutkan dalam 100 ml air.
3333.4.7.4.7.4.7.4.7 PereaksiPereaksiPereaksiPereaksi Liebermann-BurchardLiebermann-BurchardLiebermann-BurchardLiebermann-Burchard
Sebanyak 5 ml asam asetat anhidrida dicampurkan dengan 5 ml asam sulfat pekat kemudian ditambahkan etanol hingga 50 ml.
3333....5555 KarakterisasiKarakterisasiKarakterisasiKarakterisasi SimplisiaSimplisiaSimplisiaSimplisia 3333....5555.1.1.1.1 PemeriksaanPemeriksaanPemeriksaanPemeriksaan MakroskopikMakroskopikMakroskopikMakroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati sifat morfologi luar, warna, bau dan rasa dari teripang.
3333....5555.2.2.2.2 PemeriksaanPemeriksaanPemeriksaanPemeriksaan MikroskopikMikroskopikMikroskopikMikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia teripang. Serbuk simplisia ditaburkan diatas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan tutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop.
3333....5555.3.3.3.3 PenetapanPenetapanPenetapanPenetapan KadarKadarKadarKadar AirAirAirAir
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode azeotropi (destilasi toluen). Cara penetapan: ke dalam labu alas bulat dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml akuades, didestilasi selama 2 jam. Setelah toluena didinginkan dan volume air pada tabung penerima dibaca. Kemudian kedalam labu dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, dipanaskan hati–hati
selama 15 menit. Setelah toluena mendidih, kecepatan tetesan diatur, kurang lebih 2 tetes tiap detik, hingga sebagian air tersuling, kemudian naikkan kecepatan penyulingan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua tersuling, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena yang telah jenuh. Penyulingan dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin sampai suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah sempurna, volume dibaca. Selisih kedua volume air dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa (WHO, 1992).
3333....5555.4.4.4.4 PenetapanPenetapanPenetapanPenetapan KadarKadarKadarKadar SariSariSariSari LarutLarutLarutLarut DalamDalamDalamDalam AirAirAirAir
Sebanyak 5 g serbuk dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform (2,5 ml air-kloroform dalam akuades sampai 1 liter) dengan menggunakan botol bersumbat warna coklat sambil sekali-kali dikocok salama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring, sejumlah 20 ml filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan yang telah dipanaskan dan ditara. Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 105°C sampai diperoleh bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes, 1995).
3333....5555.5.5.5.5 PenetapanPenetapanPenetapanPenetapan KadarKadarKadarKadar SariSariSariSari LarutLarutLarutLarut DalamDalamDalamDalam EtanolEtanolEtanolEtanol
Sebanyak 5 g serbuk dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 % dengan menggunakan botol bersumbat berwarna coklat sambil sekali-kali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan yang telah dipanaskan dan ditara. Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 105°C
sampai diperoleh bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes, 1995).
3333....5555.6.6.6.6 PenetapanPenetapanPenetapanPenetapan KadarKadarKadarKadar AbuAbuAbuAbu TotalTotalTotalTotal
Lebih kurang 2 g zat yang telah digerus dan ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus porselin bersama isinya dipijarkan perlahan–lahan hingga arang habis, dinginkan, ditimbang sampai diperoleh bobot yang tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes, 1995).
3333....5555.7.7.7.7 PenetapanPenetapanPenetapanPenetapan KadarKadarKadarKadar AbuAbuAbuAbu YangYangYangYang TidakTidakTidakTidak LarutLarutLarutLarut DalamDalamDalamDalam AsamAsamAsamAsam
Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu total dididihkan dengan 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, kumpulkan bagian yang tidak larut dalam asam, saring dengan kertas saring, lalu cuci dengan air panas. Kemudian residu dan kertas saring dipijarkan sampai diperoleh bobot tetap, didinginkan dan ditimbang beratnya. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes, 1995).
3.6 3.6
3.63.6 PemeriksaaanPemeriksaaanPemeriksaaanPemeriksaaan SenyawaSenyawaSenyawaSenyawa KimiaKimiaKimiaKimia 3333....6666.1.1.1.1 PemeriksaanPemeriksaanPemeriksaanPemeriksaan aaaalkaloidalkaloidalkaloidalkaloida
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk uji alkaloida sebagai berikut:
a. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Mayer akan terbentuk endapan berwarna putih atau kuning.
b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai kehitaman. c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi
Dragendorff, akan terbentuk endapan merah atau jingga.
Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari tiga percobaan diatas (Depkes, 1995).
3333....6666....2222 PemeriksaanPemeriksaanPemeriksaanPemeriksaan ssssaponinaponinaponinaponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik, jika terbentuk buih yang mantap setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2N menunjukkan adanya saponin (Depkes, 1995).
3333....6666....3333 PemeriksaanPemeriksaanPemeriksaanPemeriksaan ssssteroida/teroida/teroida/teroida/ttttriterpenoidariterpenoidariterpenoidariterpenoida
Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap, dan pada sisanya ditambahkan 1 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat (pereaksi Liebermann-Burchard). Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru hijau menunjukkan adanya steroida/triterpenoida (Harborne, 1987).
3.7 3.7
3.73.7 PembuatanPembuatanPembuatanPembuatan EkstrakEkstrakEkstrakEkstrak 3.7.1
3.7.13.7.13.7.1 EkstrakEkstrakEkstrakEkstrak etanoletanoletanoletanol
Sebanyak 100 g simplisia teripang dimasukkan kedalam wadah gelas bertutup (maserator), ditambahkan etanol 96% sampai serbuk terendam sempurna kemudian diaduk dan dibiarkan selama 24 jam, kemudian disaring dan filtrat ditampung, dilakukan pengulangan selama 3 kali. Setelah itu ekstrak dipekatkan dengan rotari evaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak kental.
3.7.2
3.7.23.7.23.7.2 EkstrakEkstrakEkstrakEkstraknnnn-heksan-heksan-heksan-heksan
Sebanyak 100 g simplisia teripang dimasukkan kedalam wadah gelas bertutup (maserator), ditambahkan n-heksan sampai serbuk terendam sempurna kemudian diaduk dan dibiarkan selama 24 jam, kemudian disaring dan filtrat ditampung, dilakukan pengulangan selama 3 kali. Setelah itu ekstrak dipekatkan dengan rotari evaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak kental.
3.7.3
3.7.33.7.33.7.3 EkstrakEkstrakEkstrakEkstrak EtilEtilEtilEtil asetatasetatasetatasetat
Sebanyak 100 g simplisia teripang dimasukkan kedalam wadah gelas bertutup (maserator), ditambahkan etil asetat sampai serbuk terendam sempurna kemudian diaduk dan dibiarkan selama 24 jam, kemudian disaring dan filtrat ditampung, dilakukan pengulangan selama 3 kali. Setelah itu ekstrak dipekatkan dengan rotari evaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak kental.
3333.8.8.8.8 SterilisasiSterilisasiSterilisasiSterilisasi AlatAlatAlatAlat
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antijamur ini, disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan didalam oven pada suhu 170˚C selama 1 jam. Media disterilkan di autoklaf pada suhu 121˚C selama 15 menit. Jarum ose dan pinset dengan lampu bunsen (Lay, 1994).
3333.9.9.9.9 PembuatanPembuatanPembuatanPembuatan MediaMediaMediaMedia
3333.9.1.9.1.9.1.9.1 PotatoPotatoPotatoPotato DextroseDextroseDextroseDextrose AgarAgarAgarAgar (PDA)(PDA)(PDA)(PDA)
Sebanyak 39 gram serbuk PDA ditimbang, kemudian dilarutkan dalam aquadest sebanyak 1 liter, dipanaskan sampai mendidih untuk melarutkan semua serbuk PDA, disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121˚C selama 15 menit (Difco, 1953).
3333.9.2.9.2.9.2.9.2 LarutanLarutanLarutanLarutan NaClNaClNaClNaCl 0,9%0,9%0,9%0,9%
Komposisi : Natrium Klorida 9 g Air suling ad 1000 ml Cara Pembuatan :
Natrium klorida ditimbang sebanyak 0,9 g lalu dilarutkan dalam air suling steril sedikit demi sedikit dalam erlenmeyer 100 ml sampai larut sempurna, disterilkan di autoklaf pada suhu 121˚C selama 15 menit (Sonnenwirth, 1980).
3333.10.10.10.10 PembuatanPembuatanPembuatanPembuatan StokStokStokStok KulturKulturKulturKultur JamurJamurJamurJamur
Koloni jamur diambil dengan menggunakan jarum ose steril, lalu ditanam pada media potato dextrose agar miring dengan cara menggores.
Kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 20-25˚C selama 48 jam (Ditjen POM, 1995).
3333.11.11.11.11 PenyiapanPenyiapanPenyiapanPenyiapan InokulumInokulumInokulumInokulum JamurJamurJamurJamur
Koloni jamur diambil dari stok kultur dengan jarum ose steril lalu disuspensikan dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml larutan NaCl 0,9% (Ditjen POM, 1995). Kemudian diukur kekeruhan larutan pada panjang gelombang 520 nm sampai diperoleh transmitan 25% (Cole, 1981).
3333.12.12.12.12 PembuatanPembuatanPembuatanPembuatan LarutanLarutanLarutanLarutan UjiUjiUjiUji EkstrakEkstrakEkstrakEkstrak DenganDenganDenganDengan BerbagaiBerbagaiBerbagaiBerbagai Konsentrasi.Konsentrasi.Konsentrasi.Konsentrasi.
Ekstrak ditimbang 1,5 g dilarutkan DMSO hingga 3 ml maka konsentrasi ekstrak adalah 500 mg/ml kemudian dibuat pengenceran selanjutnya sampai diperoleh ekstrak dengan konsentrasi 400 mg/ml; 100 mg/ml; 200 mg/ml; 100 mg/ml; 90 mg/ml; 80 mg/ml; 70 mg/ml; 60 mg/ml; 50 mg/ml; 40 mg/ml; 30 mg/ml; 20 mg/ml dan 10 mg/ml.
3333.1.1.1.13333 MetodeMetodeMetodeMetode PengujianPengujianPengujianPengujian EfekEfekEfekEfek AntijamurAntijamurAntijamurAntijamur secarasecarasecarasecaraInInInIn VVVVitroitroitroitro
Ke dalam cawan petri dimasukkan 0,1 ml inokulum, kemudian ditambahkan 20 ml mediapotato dextrose agar steril yang telah dicairkan dan memiliki suhu mencapai 45˚C, kemudian dihomogenkan dan dibiarkan sampai media memadat. Setelah itu ditanamkan silinder logam. Selanjutnya masing-masing silinder logam dimasukkan ekstrak sebanyak 0,1 ml. Kemudian diinkubasi pada suhu 20-25˚C selama 48 jam. Selanjutnya diameter daerah hambat di sekitar silinder logam diukur dengan menggunakan jangka sorong.