METODE PENELITIAN
4.5 Metode Penelitian .1 Penetapan Kadar Air .1 Penetapan Kadar Air
Sampel produk teh hijau celup dan produk teh hitam celup ditimbang sebanyak 10,0 g, kemudian dioven pada suhu 105o C, selama 5 jam, lalu dinginkan pada eksikator, kemudian timbang. Pemanasan dilanjutkan selama 1 jam pada suhu yang sama lalu dinginkan pada eksikator, kemudian timbang (perbedaan dari kedua penimbangan berturut-turut tidak boleh lebih dari 0,25%) (Farmakope Indonesia V,2014).
4.5.2 Ekstraksi EGCG dari produk teh hijau dan produk teh hitam Masing-masing sampel produk teh hijau celup dan produk teh hitam celup ditimbang teliti sejumlah 2,0 gram sebanyak 3 kali penimbangan. Pada Sampel pertama dilakukan penyeduhan berulang menggunakan sampel yang sama sebanyak 3 kali selama 5 menit dengan air panas 80⁰C masing-masing sebanyak 200,0 ml lalu dimasukkan ke 3 labu ukur 200,0 ml ditambahkan aquadest ad tanda pada labu ukur yang berbeda. Sampel produk teh hijau celup dan produk teh hitam celup kedua dilakukan penyeduhan sebanyak sekali dengan air panas 80⁰C sebanyak 200,0 ml selama 10 menit lalu dimasukkan ke labu ukur 200,0 ml ditambahkan aquadest ad tanda, Sampel teh ketiga dilakukan penyeduhan sebanyak satu kali dengan air panas 80⁰C sebanyak 200 ml selama 20 menit lalu dimasukkan ke labu ukur 200,0 ml ditambahkan aquadest ad tanda. masing-masing sampel diekstraksi dengan mengambil sampel sebanyak 25,0 ml dimasukkan ke corong pisah kemudian ditambahkan dengan kloroform sebanyak 25,0 ml lalu dikocok (ekstraksi dengan kloroform dilakukan tiga
kali). Fase kloroform dibuang, dan didapat fase air kemudian dari fase air diambil sebanyak 20,0 ml dan ditambahkan dengan etil asetat sebanyak 20,0 ml dalam corong pisah kemudian dikocok (ekstraksi dengan etil asetat dilakukan tiga kali). Kemudian didapat fase etil asetat ditampung sebanyak 50,0 ml pada labu ukur, fase etil asetat tersebut diambil 25,0 lalu diuapkan hingga kering yang kemudian dilarutkan metanol pro HPLC ad 10,0 ml, sebelum disuntikkan ke KCKT larutan disaring dengan menggunakan kertas saring whatman dengan diameter pori sebesar 0,2 μm. Selanjutnya larutan disuntikan sebanyak 10,0 μl.
4.5.3 Penyederhanaan Matriks
produk teh hijau celup dan produk teh hitam celup ditimbang teliti sejumlah 2,0 gram sebanyak 3 kali penimbangan sampel pertama diseduh
berulang sebanyak 3 kali selama 5 menit, sampel kedua diseduh sekali selama 10 menit, sampel ketiga diseduh sekali selama 20 menit dengan air panas 80⁰C
Diambil 25,0 ml dimasukkan ke corong pisah tambahkan 25,0 ml kloroform (dilakukan ekstraksi kloroform tiga kali)
Fase air Fase kloroform (dibuang)
Fase air diambil 20,0 ml di ekstraksi dengan 20,0 ml etil asetat (dilakukan ekstraksi etil asetat tiga kali) Fase air (dibuang) Fase etil asetat ditampug
50,0 ml pada labu ukur
Uapkan hingga kering Hasil di larutkan dalam metanol sampai 10,0 ml
Saring dengan kertas saring whatman 0,2 μm Injekkan pada KCKT
Masing- masing Larutan dimasukan
dalam labu ukur 200,0 ml tambahkan
aquadest ad tanda
4.5.4. Penentuan Panjang Gelombang
Dibuat larutan standar EGCG dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 20 μg/ml dan 40 μg/ml . Larutan ini dibuat spektra serapannya pada panjang gelombang 220-360 nm (Martono Y et al., 2005) dengan blanko metanol. Dari hasil spektra serapan dapat dilihat panjang gelombang maksimal yang akan digunakan dalam analisis metode KCKT.
4.5.5 Optimasi fase gerak
Fase gerak yang digunakan dalam penetapan kadar EGCG ini merupakan campuran metanol : air : asam asetat 20 : 75 : 5 v/v/v (Purwanto
et al., 2010). Dibuat Larutan standar EGCG 40,0 μg/ml, larutan sampel produk teh hijau celup dan produk teh hitam celup yang telah dipreparasi, dan larutan sampel produk teh hijau celup dan produk teh hitam celup yang telah dipreparasi sebanyak 10,0 ml ditambah larutan standar EGCG 40,0 μg/ml. Masing-masing larutan disaring dengan kertas whatman 0,2 μm disuntikkan sebanyak 10,0 μl ke KCKT yang dieluasi dengan fase gerak tersebut dengan kecepatan alir 1,0 ml/min.
4.5.6 Spesifisitas
Dibuat larutan baku EGCG, larutan uji sampel dan blanko dengan menggunakan metanol. Larutan baku EGCG dibuat dengan kadar 40,0 μg/ml kemudian disaring menggunakan penyaring whatman berdiameter 0,2 μm. Selanjutnya sebanyak 10,0 μl sampel produk teh hijau celup dan produk teh hitam celup yang telah diekstraksi disuntikkam kedalam KCKT. Pada daerah sekitar waktu retensi EGCG tidak boleh ditemukan adanya gangguan yang dapat dilihat dari profil kromatogram. Selain itu juga dilakukan perhitungan harga Resolusi (Rs). Uji spesifisitas dikatakan
memenuhi persyaratan apabila nilai α lebih besar dari 1 dan Rs lebih besar dari 1,5.
4.5.7 Linearitas
Seri larutan baku dibuat pada konsentrasi 5,0; 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 100,0; dan 400,0 μg/ml. Kemudian larutan disaring dengan kertas saring whatman dengan diameter pori 0,2 μm yang selanjutnya diinjekkan ke KCKT. Kemudian membuat persamaan garis regresi y = bx + a dengan kadar EGCG sebagai variabel x dan area masing – masing puncak sebagai variabel y lalu dihitung harga r dan Vxo.
4.5.8 Penetapan Batas Deteksi Dan Kuantitasi
Batas deteksi dan batas kuantitasi ditentukan dengan menginjekkan berbagai konsentrasi, sehingga dibuat larutan standar EGCG dengan konsentrasi (0,10; 0,25; 0,50; 1,00; 1,50; 2,50; 5,00; 6,00; 8,00; dan 10,00 μg/ml). Larutan tersebut disaring dengan kertas saring whatman dengan diameter pori 0,2 μm kemudian disuntikkan sebanyak 10,0 μl ke KCKT. Dari hasil eluasi akan didapatkan data luas area untuk dibuat persamaan garis. Perhitungan batas deteksi dilakukan dengan menggunakan rumus berikut :
Keterangan : SD = Standart deviasi
b = slope (b pada persamaan garis y=bx+a)
Keterangan : SD = Standart deviasi
b = slope (b pada persamaan garis y=bx+a)
4.5.9 Presisi a. Presisi Intraday
Larutan standar EGCG 40,0 μg/ml diinjekkan pada KCKT dan dieluasi dengan fase gerak terpilih sebanyak 6 kali kemudian dihitung nilai KV.
b. Presisi Interday
Larutan standar EGCG 40,0 μg/ml diinjeksikan pada KCKT, dieluasi dengan fase gerak terpilih sebanyak 6 kali pada hari yang berbeda kemudian dihitung nilai KV.
4.5.10 Akurasi dan Presisi Metode
Timbang secara teliti sampel produk teh hijau celup dan produk teh hitam celup dengan variasi berat (2,00; 1,80; 1,60; 1,40; 1,20 dan 1,00 g) kemudian ditambahkan standar EGCG sebanyak 56,0 mg pada sampel teh hijau untuk konsentrasi 80%, 70,0 mg untuk konsentrasi 100%, dan 84,0 mg untuk konsentrasi 120%. Pada teh hitam celup ditambahkan standar EGCG sebanyak 24,0 mg untuk konsentrasi 80%, 30,0 mg untuk konsentrasi 100% dan 36,0 mg untuk konsentrasi 120%, kemudian dilakukan proses ekstraksi seperti pada poin (4.5.2) hingga ditambah metanol 10,0 ml. Setelah itu larutan disaring menggunakan kertas saring whatman berdiameter 0,2 μm dan diinjeksikan kedalam KCKT. perbandingan kromatogram dari hasil pembacaan alat dan dihitung harga % perolehan kembali. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
4.5.11 Penetapan Kadar EGCG
Penetapan kadar EGCG pada produk teh hijau celup dan produk teh hitam celup, dilakukan dengan menimbang produk teh hijau celup dan produk teh hitam celup sebanyak 2,0 gram (penimbangan dilakukan sebanyak 5 kali) kemudian ditambahkan standar EGCG sebanyak 10,0; 12,0; 14,0; 16,0; 18,0 mg ke masing-masing sampel, kemudian dilakukan proses ekstraksi seperti poin (4.5.2) hingga ditambah metanol 10,0 ml. Setelah itu larutan disaring menggunakan kertas saring whatman berdiameter pori 0,2 μm dan diinjeksikan kedalam KCKT, selanjutnya dari kromatogram diperoleh area dan diintrapolasikan pada kurva baku sehingga dapat diketahui kadar EGCG pada produk teh hijau celup, dan produk teh hitam celup.
BAB V
