Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli 2006 sampai April 2007 di Laboratorium Histologi. Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
Materi dan Alat Penelitian
Pada penelitian ini digunakan tikus putih jantan (Rattus norvegicus) strain
Sprague Dawley sebanyak 18 ekor berumur 21 hari dengan berat 50 g. Bahan lain yang digunakan adalah larutan fiksatif bouin, alkohol, xylol, parafin, NaCl fisiologis 0.9%, phosphat buffer saline (PBS), destilated water (DW), H2O2, metanol, goat serum albumin (GSA), larutan pewarna hematoksilin eosin (HE), antibodi monoklonal superoxide dismutase (SOD), dako envision peroksidase system (DEPS), diaminobenzidine (DAB), tris buffer, dan entelan.
Alat yang digunakan terdiri atas seperangkat alat bedah, gelas piala, gelas obyek, kaca penutup, pipet, mikropipet, mikrotom (rotary) dan mikroskop cahaya.
Metode Penelitian 1. Perlakuan Hewan
Tikus diadaptasikan dahulu selama 7 hari dengan pemberian pakan standar kasein, lalu dibagi menjadi 6 kelompok perlakuan :
1. Kelompok K
Diberi ransum standar tanpa isoflavon maupun vitamin E dan Zn.
2. Kelompok I
Diberi ransum standar dengan isoflavon.
3. Kelompok ZE
Diberi ransum standar dengan vitamin E dan Zn.
4. Kelompok IE
Diberi ransum standar dengan isoflavon dan vitamin E.
5. Kelompok IZ
Diberi ransum standar dengan isoflavon dan Zn
6. Kelompok IZE
Tabel 1. Komposisi Ransum untuk pembuatan 100 g ransum tikus jantan
Komposisi bahan Perlakuan
K I ZE IZ IE IZE Kasein (g) 16.64 16.64 16.64 16.64 16.64 16.64 Minyak jagung (g) 7.91 7.91 7.91 7.91 7.91 7.91 Mineral mix (g) 4.35 4.35 4.35 4.35 4.35 4.35 ZnSO4.7H2O - - 2.7 2.7 - 2.7 Vitamin (g) 1 1 1 1 1 1 (multivitaplex) Asam folat (mg) 30 30 30 30 30 30 Vitamin K (mg) 5 5 5 5 5 5 Vitamin E (mg) - - 50 - 50 50 Selulosa 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 Air 4.28 4.28 4.28 4.28 4.28 4.28 pati 64.83 64.83 64.83 64.83 64.83 64.83 Jumlah 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
2. Preparasi Jaringan dan Fiksasi
Pengambilan sampel organ hati dilakukan di akhir perlakuan. Organ hati dicuci dengan NaCl fisiologis 0.9% sebelum dimasukkan ke dalam larutan fiksatif. Organ hati lalu difiksasi dengan larutan bouin selama 24 jam.
3. Dehidrasi
Setelah proses fiksasi selesai organ hati dimasukkan ke dalam alkohol 70% (stopping point). Sampel jaringan dipotong dan dimasukkan ke dalam
tissue cassete serta diberi label dengan kertas film.
Langkah selanjutnya adalah dehidrasi, sampel jaringan dimasukkan ke dalam botol-botol yang berisi alkohol bertingkat dengan konsentrasi 80%, 90%, dan 95% masing-masing selama 24 jam. Kemudian sampel jaringan dimasukkan ke dalam botol yang berisi larutan alkohol absolut sebanyak tiga kali masing- masing selama 1 jam.
4. Clearing dan Infiltrasi Parafin
Sampel jaringan yang telah didehidrasi kemudian dijernihkan dengan dimasukkan ke dalam botol-botol yang berisi xylol I, xylol II, xylol III secara
berurutan masing-masing selama 1 jam dan dilanjutkan dengan infiltrasi parafin. Parafin yang digunakan adalah parafin cair di dalam oven dan dibagi menjadi parafin I, parafin II, parafin III sampel jaringan dimasukkan ke dalam parafin secara berurutan masing-masing selama 1 jam.
5. Embedding
Alat-alat yang akan digunakan dalam embedding dihangatkan terlebih dahulu agar parafin tidak mengeras, Selama proses embedding harus dilakukan dekat dengan sumber panas. Blok yang yang sudah mengeras ditrimming
kemudian dilekatkan pada blok kayu, kemudian disimpan dalam lemari es. Prosedur pembuatan sediaan dapat dilihat di lampiran 1.
6. Sectioning
Blok parafin tersebut kemudian dipotong setebal 5 µm dengan menggunakan mikrotom putar (rotary microtome). Setelah dipotong, potongan jaringan diapungkan dalam air dingin selama beberapa saat dan air hangat kemudian potongan jaringan dilekatkan pada obyek gelas. Obyek gelas yang telah dilekatkan dengan potongan jaringan diberi label dan tanda. Tahap selanjutnya potongan jaringan diinkubasi dalam inkubator (37°C) selama satu malam sebelum proses pewarnaan.
7. Staining
Staining (pewarnaan) yang digunakan dalam penelitian ini adalah pewarnaan umum Hematoksilin Eosin (HE) dan pewarnaan secara imunohistokimia terhadap Cu, Zn-SOD.
1. Pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE)
Pewarnaan hematoksiiln eosin pada penelitian ini menggunakan metode Kiernan (1990). Morfologi umum jaringan hati diamati menggunakan pewarnaan Hematoksilin Eosin. Pewarnaan ini dimulai dengan proses penarikan paraffin dengan xylol III, II, I masing-masing selama 3 menit, lalu dilanjutkan dengan proses rehidrasi dengan alkohol absolut sampai alkohol 70% masing-masing selama 3 menit. Potongan jaringan lalu dimasukan ke dalam air kran selama 5 menit dan Destilated Water (DW) selama 5 menit, kemudian diwarnai dalam hematoksilin selama 1 menit dan direndam kembali dalam air kran (5 menit) dan
DW (5 menit). Kemudian potongan jaringan diwarnai dengan eosin selama 2 menit dan dilakukan dehidrasi dengan alkohol bertingkat mulai alkohol 70% sampai alkohol absolut serta penjernihan dengan xylol I, II, dan III. Potongan jaringan di-mounting dengan entelan, ditutup dengan cover glass dan siap diamati. Prosedur pewarnaan ini dapat dilihat di lampiran 2.
2. Pewarnaan Imunohistokimia
Pewarnaan imunohistokimia mempelajari distribusi enzim yang spesifik serta mendeteksi komponen sel. Pewarnaan ini dilakukan untuk mengamati kandungan enzim antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati tikus. Pewarnaan ini dimulai dengan deparaffinisasi, rehidrasi dan dimasukkan ke dalam DW selama 15 menit, kemudian potongan jaringan dimasukan ke dalam larutan hidrogen peroksida dalam metanol dengan perbandingan 1 : 30 selama 15 menit untuk menghilangkan aktivitas peroksidase endogen dan direndam kembali dalam DW serta dicuci dengan phosphate buffer saline (PBS) secara berurutan sebanyak dua kali masing-masing selama 10 menit. Potongan jaringan diinkubasi dalam serum normal sebanyak 60 μl/preparat pada suhu 37 °C selama 60 menit untuk menutupi bagian antigen yang tidak spesifik lalu dicuci dengan PBS sebanyak tiga kali selama 5 menit. Proses selanjutnya potongan jaringan diinkubasi dengan antibodi monoklonal Cu,Zn-SOD (pengenceran 1:200) sebanyak 60 μl/preparat di refrigerator selama 2 malam. Potongan jaringan dicuci dengan PBS sebanyak tiga kali selama 10 menit kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi (Dako Envision Peroxide System) sebanyak 60 μl pada suhu 37 °C selama 60 menit dalam suasana gelap. Potongan jaringan kemudian dicuci dengan PBS sebanyak tiga kali selama 5 menit lalu dimasukkan ke dalam larutan DAB dalam tris buffer dan hidrogen peroksida selama 25 menit dalam keadaan gelap. Tahap selanjutnya dilakukan counterstain menggunakan hematoksilin dan memasuki tahap akhir, dilakukan dehidrasi, clearing dan mounting.
Pengamatan dan Analisis Data
Jaringan yang telah diwarnai dengan HE diamati di bawah mikroskop cahaya pada pembesaran 20X untuk melihat morfologi umum jaringan hati tiap kelompok perlakuan. Pada pewarnaan imunohistokimia dilakukan pengamatan terhadap kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati masing-masing
kelompok perlakuan. Produk imunoreaksi dari Cu,Zn-SOD diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya. Pengamatan kandungan Cu,Zn-SOD secara kualitatif dilihat produk reaksi berupa warna coklat pada inti dan sitoplasma sel hati. Pengamatan kuantitatif kandungan SOD dilakukan terhadap produk hasil reaksi dari antibodi dan antigen SOD pada inti sel hati dengan berbagai tingkatan kandungan Cu,Zn-SOD. Perbedaan intensitas yang terbentuk akibat reaksi tersebut dapat dibagi atas tiga tingkatan intensitas warna untuk reaksi positif dan satu intensitas warna untuk reaksi negatif. Reaksi positif terdiri dari positif kuat yang ditunjukkan dengan warna coklat tua sampai kehitaman (+++), positif sedang yang ditunjukkan dengan warna coklat muda (++) dan positif lemah yang ditunjukkan dengan warna coklat yang bercampur biru (+). Sel yang tidak mengandung enzim Cu,Zn-SOD atau reaksi negatif ditunjukkan dengan warna biru (-). Pada pengamatan kuantitatif dilakukan pada 5 lapang pandang pada setiap sampel jaringan. Pada perhitungan persentase dilakukan penghitungan jumlah inti sel hati yang bereaksi pada berbagai tingkat kandungan antioksidan Cu,Zn- SOD.
Hasil pengamatan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati diamati secara kuantitatif yang disusun sebagai Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan analisis sidik ragam ANNOVA dan uji Lanjutan-Duncan (Steel dan Torrie 1989).