Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Polimer FMIPA USU, di Laboratorium Teknologi Hasil Hutan, di laboratorium Bioteknologi Departemen Kehutanan, di Areal Perkebunan Tembakau PTPN II, dan untuk melakukan uji Fitokimia dilakukan di Laboratorium Kimia Bahan Alam Universitas Sumatera Utara. Waktu pelaksanaan dilaksanakan pada bulan Mei 2009 sampai bulan Agustus 2009.
Bahan dan Alat Penelitian
Bahan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah serbuk daun mindi (M. azedarach), ulat grayak (S. litura), daun tanaman tembakau deli (N. tobacco),
Phytium sp, pelarut aseton, metanol, akuades, kain kasa, kertas saring, kentang,
agar-agar, dekstrosa, kertas transparansi, kantungan plastik, pena transparansi, kapas steril, aluminium foil, tissue steril, chlorox 1%.
Alat yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah blender untuk menghaluskan serbuk, saringan dengan ukuran 40 mesh, batang pengaduk untuk mengaduk larutan, labu erlenmeyer, alat suntik (injeksi), tabung reaksi, mangkok jaring-jaring, autoclave, cawan petri, rotary evaporator, timbangan, oven, camera, mikroskop, sprayer.
Metode Penelitian Persiapan Bahan Baku
Diambil daun mindi yang segar kemudian bahan dikeringkan hingga mencapai kadar air 15%, kemudian bahan dihaluskan atau ditumbuk dengan menggunakan tumbukan atau blender, kemudian bahan disaring dengan ukuran 40-60 mesh dan dimasukkan masing-masing bahan kedalam kantungan plastik yang berukuran besar.
Gambar 4. Serbuk Daun Mindi
Ekstraksi Daun Mindi
Gambar 5. Proses Evaporasi
Serbuk daun mindi yang telah kering diambil sebanyak 500 gram, masing- masing diekstrak dengan pelarut aseton, metanol dan akuades dengan metode perendaman pada suhu ruangan selama 2 hari dengan perbandingan tinggi serbuk
dan pelarut 1:3 dalam stoples, campuran ini diaduk dengan selang waktu 2 jam dengan menggunakan spatula, hasil ekstraksi tersebut disaring dengan menggunakan kertas saring, hasil saringan tersebut di masukkan ke dalam botol residunya direndam kembali selama 2 hari. Kegiatan perendaman dan penyaringan ini diulang sebanyak 3 kali. Hasil masing-masing ekstraksi tersebut kemudian dievaporasi sampai volumenya 100 mililiter. Dari ekstraksi diambil 10 mililiter, kemudian dievaporasi sampai kering setelah itu baru dioven untuk mengetahui kadar ekstraknya.
Kadar Ekastrak = X100% Eksraksi Sebelum Serbuk Kering Bobot Ekstrak Kering obot B
Gambar 6. Hasil Evaporasi Ekstrak Daun Mindi
Pembuatan Konsentrasi Larutan untuk Penyemprotan
Tahap selanjutnya setelah melakukan ekstraksi bertahap dan diperoleh padatan ekstraktif yang dilakukan dengan pengeringan oven pada suhu 35oC adalah pembuatan konsentrasi larutan zat ekstraktif dengan menggunakan pelarut aseton, metanol dan akuades. Masing-masing hasil ekstraksi (aseton, metanol, dan akuades) dibuat 5 taraf konsentrasi larutan bahan penyemprotan ekstraktif, yaitu : 0, 1, 2, 3, 4%. Penentuan konsentarsi larutan berdasarkan volume semprot.
Gambar 7. Ekstrak Aseton pada Beberapa Konsentrasi
Gambar 8. Ekstrak Metanol pada Beberapa Konsentrasi
Gambar 9. Ekstrak Akuades pada Beberapa Konsentrasi
Penyemprotan Pada Larva (S. litura)
Pada tahap penyemprotan ini sebelum dilakukan aplikasi penyemprotan pada larva (S. litura), disiapkan larva ulat grayak terlebih dahulu sebanyak 15 ekor. Untuk setiap botol pengujian diletakkan ± 5 helai daun muda tembakau dan ditambah 1 pucuk tembakau. Daun kemudian disemprot dengan ekstrak mindi
sesuai dengan konsentrasi perlakuan. Larva ulat grayak dimasukkan ke dalam wadah pengujian sebanyak 15 ekor per wadah dan disemprot lagi dengan ekstrak mindi. Sebelumnya bagian dasar wadah telah diberi tanah setinggi ± 1 cm. Untuk menjaga kesegaran daun maka pada pangkal daun ditutup dengan kapas basah.
Gambar 10. Wadah Pengujian S. litura
Perhitungan Larva S. litura yang Mati
Perhitungan larva ulat grayak yang mati dilakukan setiap dua hari setelah dilakukan penyemprotan, dan diamati selama 12 hari. Perhitungan nilai mortaslitas dilakukan setiap dua hari setelah penyemprotan dengan menggunakan rumus Schneider- Orelli yaitu :
Ki = 15
Mi
X 100 % (Hennarti, 1996)
Keterangan:
Ki = Persen kematian ulat grayak pada contoh uji Mi = Jumlah mortalitas ulat grayak pada contoh uji.
Penyediaan Biakan Fungi Phytium sp a. Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)
Kentang yang telah dikupas dan dipotong-potong dengan ukuran 3
empuk. Hal ini dapat diketahui dengan menusuk kentang dengan garpu jika ditusuk terasa mudah berarti kentang telah mengeluarkan sarinya. Kemudian 15 gram agar-agar dimasak dengan menggunakan air steril sebanyak 500 ml sampai agar-agar larut, selanjutnya dekstrosa (dapat diganti dengan gula pasir) sebanyak 15 gram dimasukkan ke dalamnya. Air ekstrak kentang selanjutnya dituangkan ke dalam larutan agar-agar. Larutan ini kemudian disaring dengan kain katun yang tipis. Larutan ditambahkan air steril sampai volumenya menjadi 1000 ml.
Setelah dididihkan, larutan PDA dimasukkan ke dalam Erlenmeyer kemudian ditutup dengan kapas steril dan ditutup lagi dengan menggunakan alumunium foil. Kemudian disterilkan di dalam autoclave selama lebih kurang 15 menit dengan suhu 121-124 oC pada tekanan 1,25 atm. Setelah itu, PDA dikeluarkan dan dibiarkan hingga dingin (10-20 oC), kemudian dituangkan ke dalam cawan petri.
b. Isolasi Fungi
Bagian batang atau daun tembakau yang terinfeksi Phytium sp diambil dari persemaian tembakau deli PTPN II, kemudian dibersihkan dengan menggunakan air steril, dipotong persegi 0,5 x 0,5 x 0,2 cm3 lalu disterilkan dengan chlorox 1 % selama 15 – 30 detik lalu potongan tersebut diambil dengan menggunakan pinset dan dicuci dengan air dan dikeringkan di atas kertas tissue steril. Selanjutnya bagian tersebut ditanam dalam media PDA, dimana tiap cawan petri ditanam secara tiga ulangan dan dibiarkan sampai miselium fungi tumbuh pada media biakan tersebut. Lalu diisolasi kembali sampai didapat biakan murni dari tiap warna biakan. Hal ini dilakukan berkali-kali sampai diperoleh biakan yang benar- benar murni.
Gambar 11. Biakan Murni Phytium sp
c. Identifikasi Fungi
Biakan murni fungi yang tumbuh pada media biakan diisolasi dan diletakkan di atas gelas benda yang telah steril lalu ditutup dengan gelas penutup kemudian diamati di bawah mikroskop untuk diidentifikasi dengan menggunakan buku acuan hama dan penyakit tembakau deli.
Perlakuan Fungi Phytium spdengan Ekstraktif Daun Mindi
Media PDA yang berada di dalam cawan petri diinokulasi dengan cendawan yang telah tumbuh aktif, dengan cara meletakan satu isolat seukuran 12 mm2. Sebelumnya pada media tersebut diteteskan 1 tetes ekstraktif daun mindi (0,5 ml) sesuai konsentrasinya dan digoyang-goyang supaya merata pada seluruh media cawan petri tersebut. Sedangkan kontrol ditetesi pelarut (aseton, metanol, akuades) untuk mengetahui pengaruh murni dari fungisida terhadap pertumbuhan fungi. Masing-masing perlakuan terdiri dari 3 cawan petri sebagai ulangan.
Gambar 12. Cawan Petri yang Berisi Biakan Murni Phytium sp
Pengukuran Penekanan Pertumbuhan Fungi
Pengamatan pertumbuhan fungi dilakukan setiap hari dengan mengukur luasan pertumbuhan miselium fungi. Pengukuran dilakukan sampai dengan hari ke-5.
Perhitungan Penekanan Pertumbuhan Fungi
Perhitungan penekanan pertumbuhan fungi didasarkan pada rumus :
Penekanan Pertumbuhan = X100 %
MK MP MK
MK = Luas pertumbuhan miselium fungi dari perlakuan kontrol (mm2) MP = Luas pertumbuhan miselium fungi dari perlakuan fungisida (mm2)
Tingkatan penekanan pertumbuhan fungi untuk mengetahui yang paling berpengaruh terhdap pertumbuhan fungi ditentukan sebagai berikut :
a. Sehat, bila pertumbuhan fungi tidak tertekan sama sekali b. Tertekan ringan, bila penekanan pertumbuhan fungi 0-25% c. Tertekan sedang, bila penekanan pertumbuhan fungi 25-50% d. Tertekan berat, bila penekanan pertumbuhan fungi 50-75% e. Tertekan sangat berat, bila penekanan pertumbuhan fungi 75-99% f. Mati, bila tidak ada tanda-tanda pertumbuhan fungi.
Uji Fitokimia
Gambar 13. Pereaksi-pereaksi dalam Pengujian Fitokimia Adapun prosedur pengujian fitokimia yang dilakukan adalah : a. Pengujian Triterpenoida
Sebelum melakukan uji triterpenoida terlebih dahulu disiapkan larutan pereaksi Salkowsky, CeSO4 1%, Liebermann-Burchard. Sebanyak 20 bagian asam asetat anhidrat dicampurkan dengan 1 bagian asam sulfat pekat, setelah selesai melakukan pelarutan maka kita melakukan pengujian triterpenoida yaitu :
Sebanyak 1 gr serbuk dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, kemudian disaring, lalu filtrat diuapkan dalam cawan penguap, dan pada sisanya ditambahkan 2 tetes peraksi Salkowsky, CeSO4 1%, Liebermann-Burchard. Apabila terbentuk warna merah kecoklatan, orange dan biru kehijauan adanya triterpenoida.
Jika langsung terjadi perubahan warna setelah dilakukan 3 tetes pereaksi maka menghasilkan banyak (+++) senyawa triterpenoida, dan apabila belum terjadi perubahan warna dapat ditambah 3 tetes pereaksi kembali baru terjadi perubahan warna maka menghasilkan sedang (++) senyawa triterpenoida, serta apabila belum juga terjadi perubahan warna setelah ditetes kembali sebanyak 3 tetes pereaksi maka menghasilkan sedikit (+) senyawa triterpenoida.
b. Pengujian Saponin
Sebanyak 0,5 gr serbuk dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian tambahkan air panas 10 ml kemudian didinginkan. Kocok kuat-kuat selama 10 detik bila terdapat senyawa saponin akan terbentuk buih stabil kurang lebih 10 menit, dengan ketinggian buih 1-10 cm dan buih tidak hilang jika ditambahkan 1 tetes HCl 2N. Jika ketinggian buih mencapai 1-10 cm maka menghasilkan senyawa saponin yang banyak (+++), pada ketinggian buih 1-7 menghasilkan senyawa saponin sedang (++), dan ketinggian buih 1-4 menghasilkan senyawa saponin sedikit (+).
c. Pengujian Flavonoida
Sebanyak 0,5 gr serbuk disaring dengan 10 ml metanol, direfluks selama 10 menit, kemudian disaring, filtrat diencerkan dengan 10 ml air suling. Setelah dingin ditambahkan 5 ml eter minyak tanah, dikocok hati-hati, didiamkan. Lapisan metanol diambil, diuapkan pada temperatur 40oC. sisa dilarutkan dalam 5 ml etil asetat, kemudian disaring. Filtrat digunakan untuk uji flavonoida dengan cara :
1. Sebanyak 1 ml larutan percobaan diuapkan sampai kering, sisanya dilarutkan dalam 1-2 ml etanol 95% lalu ditambahkan 0,5 gr serbuk seng dan 2 ml asam klorida 2N. Didiamkan selama 1 menit, kemudian ditambahkan 10 tetes asam klorida pekat, jika dalam 2-5 menit terjadi perubahan warna merah intensif menunjukan adanya flavonoida.
2. Sebanyak 1 ml larutan percobaan diuapkan sampai kering, sisanya dilarutkan dalam 1 ml etanol 95% lalu ditambah 0,1 gr magnesium dan 10
tetes asam kolorida pekat. Jika terjadi perubahan warna jingga sampai merah ungu menunjukkan adanya flavonoida.
Jika langsung terjadi perubahan warna setelah dilakukan 3 tetes pereaksi maka menghasilkan banyak (+++) senyawa flavonoida, dan apabila belum terjadi perubahan warna dapat ditambah 3 tetes pereaksi kembali baru terjadi perubahan warna maka menghasilkan sedang (++) senyawa flavonoida, serta apabila belum juga terjadi perubahan warna setelah ditetes kembali sebanyak 3 tetes pereaksi maka menghasilkan sedikit (+) senyawa flavonoida.
d. Pengujian Alkaloida
Serbuk ditimbang sebanyak 0,5 gr, kemudian ditambah 1 ml asam klorida 2N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut :
1. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih / kuning.
2. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes pereaksi Dragendoff, akan terbentuk warna merah / jingga.
3. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes pereaksi Bouchardat dan Wagner akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam. Jika langsung terjadi perubahan warna setelah dilakukan 3 tetes pereaksi maka menghasilkan banyak (+++) senyawa alkaloida, dan apabila belum terjadi perubahan warna dapat ditambah 3 tetes pereaksi kembali baru terjadi perubahan warna maka menghasilkan sedang (++) senyawa alkaloida, serta apabila belum juga terjadi perubahan warna setelah ditetes kembali sebanyak 3 tetes pereaksi maka menghasilkan sedikit (+) senyawa alkaloida.