3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei sampai dengan November 2017, di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: cawan petri, tabung reaksi, rak tabung reaksi, beaker glass, gelas ukur, mikropipet, spatula, jarum ose, spektrofotometer, penggaris, mikroskop, erlenmeyer, inkubator bakteri dan jamur, sprayer, vortex, object glass, cover glass, gunting, pinset dan botol selai.
Bahan- yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: rumput angin (Spinifex littoreus (Burm. F) Merr), isolat jamur patogen yang diisolasi dari tanaman jagung, media Nutrien Agar (NA), Potato Dextrose Agar (PDA), yeast extract, akuades, natrium hipoklorit, alkohol 70%, kertas saring, spiritus, aluminium foil, Triple Sugar Iron Agar (TSIA), Simon’s Citrate Agar (SCA), Sulfid Indol Motility (SIM), H2O2 3%, gelatin dan blank disc (Oxoid).
3.3 Isolasi Bakteri Endofit
Rumput angin diambil dari kawasan Pantai Cermin Kabupaten Serdang Bedagai, Sumatera Utara. Tumbuhan rumput angin yang sehat dikoleksi dan dibilas untuk menghilangkan kotoran yang menempel pada permukaan bagian tanaman dan dikeringanginkan. Sampel rumput angin dimasukkan ke dalam kantung plastik yang steril dan dibawa ke Laboratorium Mikrobiologi FMIPA USU. Bakteri endofit diisolasi berdasarkan metode Yeh and Kirschner (2014) dengan modifikasi pada konsentrasi larutan dan waktu perendaman. Sampel rumput angin dicuci dengan air bersih dan dipisahkan bagian akar, batang, dan daun. Setiap bagian dari rumput angin dipotong menjadi ±3 cm. Permukaan setiap potongan bagian rumput angin disterilisasi secara berurutan dengan cara direndam ke dalam alkohol 70% selama 2
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
menit, larutan sodium hipoklorit (NaOCl) 5,25% (bagian akar selama 1 menit, batang selama 2 menit, dan daun selama 1 menit), alkohol 70% selama 30 detik dan dibilas menggunakan aquades steril, lalu ditiriskan di dalam cawan petri yang berisi kertas saring steril. Selanjutnya, setiap potongan bagian rumput dibelah menjadi dua bagian dan diletakkan pada permukaan media NA steril dan diinkubasi selama ±24 jam.
Isolat bakteri endofit yang tumbuh dimurnikan ke dalam media NA dan dikarakterisasi secara makroskopis dan mikroskopis.
3.4 Isolasi dan Identifikasi Jamur Patogen
Isolat jamur patogen diisolasi dari tanaman jagung dengan gejala penyakit busuk pada pangkal batang (Gambar 3.4.1). Isolasi jamur patogen dilakukan dengan sterilisasi permukaan menggunakan metode Narayanasamy (2011). Batang jagung yang menunjukkan gejala penyakit dipotong menjadi tiga bagian dan direndam secara berurutan ke dalam alkohol 70% selama 1 menit, natrium hipoklorit 5,25%
selama 30 detik dan dibilas dengan akuades steril, lalu ditiriskan di dalam cawan petri yang berisi kertas saring steril. Setiap potongan batang dibelah menjadi dua bagian dan diletakkan pada permukaan media PDA dengan posisi potongan bagian yang memiliki gejala penyakit diletakkan ke arah media, lalu kultur diinkubasi selama ±48 jam. Koloni yang muncul dimurnikan ke media PDA baru yang steril.
Selanjutnya, isolat jamur patogen dikarakterisasi secara makroskopis dan mikroskopis berdasarkan warna dan bentuk koloni, warna dan bentuk konidia dengan buku identifikasi jamur Alexopoulus dan Mims (1979).
Gambar 3.4.1 Gejala penyakit busuk batang pada tanaman jagung
3.5 Uji Patogenitas (Postulat Koch)
Uji postulat Koch dilakukan dengan tujuan untuk membuktikan bahwa jamur R. solani yang diperoleh merupakan agen penyebab penyakit. Tanaman jagung yang digunakan merupakan kecambah jagung yang berumur 1 minggu. Sumber inokulum diperoleh dengan cara memotong bagian isolat jamur masa inkubasi 5 hari pada media agar dengan menggunakan cock borer. Sebanyak 3 potongan blok agar jamur diinokulasikan ke dalam botol kaca berisi tanah steril dan diinkubasi selama seminggu. Setelah itu, tanah yang terinfeksi jamur R. solani diambil sebanyak satu gram dan diinokulasikan ke botol media tanah baru. Kecambah jagung dipindahkan ke masing-masing botol yang telah diberi perlakuan (ada dan tanpa pemberian jamur R. solani) dan diamati gejala penyakit yang terjadi pada tanaman jagung.
3.6 Uji Antagonis Bakteri Endofit terhadap Jamur Rhizoctonia solani secara In Vitro
Uji antagonis dilakukan dengan tujuan mendapatkan isolat bakteri endofit yang berpotensi menghambat pertumbuhan jamur R. solani. Pengujian dilakukan dengan cara menumbuhkan jamur R. solani di tengah media PDA + 3% yeast ekstrak dengan jarak 2,5 cm dari cakram tempat inokulum bakteri endofit. Selanjutnya suspensi bakteri endofit yang telah dibuat dengan konsentrasi ≈ 108 CFU/ml diinokulasikan pada kertas cakram dengan diameter 0,6 cm di bagian tepi media sebanyak 10 μl dengan 2 kali ulangan. Pengamatan dimulai dari hari pertama sampai hari kelima. Aktivitas penghambatan ditentukan dengan mengukur daerah hambatan yang terbentuk di sekitar koloni.
Gambar 3.6.1 Template uji antagonis bakteri endofit terhadap R.solani Titik penempatan Jamur
Hasil pengukuran miselium jamur yang terhambat (Gambar 3.6.1), kemudian dihitung dengan menggunakan rumus yang sama pada penelitian Montealegre et al.
(2003), yaitu sebagai berikut:
d1 = Diameter koloni jamur R. solani yang pertumbuhannya normal d2 = Diameter R. solani yang pertumbuhannya terhambat
3.7 Pengamatan Hifa Abnormal
Pengamatan mikroskopis hifa abnormal jamur R. solani dilakukan dengan mengamati bagian ujung miselium jamur R. solani pada daerah yang terhambat pertumbuhannya. Ujung miselium jamur R. solani yang tumbuh pada permukaan media PDA+3% yeast ekstrak dipotong berbentuk block square, kemudian diletakkan pada object glass. Selanjutnya diamati abnormalitas pertumbuhan miselium jamur R. solani yang dapat berupa pembengkokan ujung miselium, miselium pecah, miselium berbelah, miselium bercabang, miselium lisis dan miselium tumbuh kerdil (Lorito et al., 1993).
3.8 Uji Hipersensitivitas Bakteri Endofit pada Daun Tembakau
Isolat bakteri yang berpotensi menghambat jamur R. solani secara in vitro dipilih untuk diaplikasikan ke tanaman jagung. Untuk mengetahui sifat patogenitas isolat bakteri tersebut terhadap tanaman maka dilakukan uji hipersensitif. Tanaman indikator yang digunakan untuk uji hipersensitifitas adalah tanaman tembakau (Klement et al., 1964) dan dilakukan berdasarkan metode Schaad et al. (2001).
Bakteri endofit ditumbuhkan dalam 5 mL media NB 100% dan di shaker selama ±24 jam. Suspensi bakteri endofit sebanyak 1 ml diinfiltrasi ke jaringan daun tanaman tembakau menggunakan syringe steril dan kondisi daun tanaman tembakau diamati setelah ±48 jam. Ketentuan yang digunakan adalah jika terjadi nekrosis maka bakteri tersebut berpotensi sebagai patogen pada tanaman dan tidak digunakan pada pengujian selanjutnya.
3.9 Perbanyakan dan Pembuatan Suspensi Bakteri Endofit
Isolat bakteri endofit diremajakan pada media NA dan diinkubasi selama ±24 jam. Suspensi bakteri endofit yang akan diinokulasikan ke benih tanaman jagung dibuat dengan cara menambahkan 5 ml NaCl fisiologis ke biakan murni bakteri di dalam cawan petri dan dikikis dengan menggunakan hockey stick untuk melepaskan bakteri dari media NA. Setelah itu, suspensi bakteri endofit dipipet dan ditambahkan ke dalam 45 ml media NB dan dihomogenkan dengan shaker selama 3 menit.
Suspensi bakteri endofit diukur absorbansinya untuk mendapatkan OD600 = 0,5 (≈
108 CFU/ml) pada spektrofotometer.
3.10 Uji Potensi Bakteri Endofit terhadap Jamur Rhizoctonia solani
Benih tanaman jagung direndam ke dalam 50 ml suspensi bakteri endofit yang terpilih dengan konsentrasi OD600 = 0,5 (≈ 108 CFU/ml) dan akuades steril sebagai kontrol selama 30 menit dengan wadah tertutup. Setelah perendaman, masing-masing benih ditanam ke dalam polybag yang berisi 500 gram campuran tanah dan kompos dengan perbandingan 2:1, lalu dikecambahkan selama 7 hari.
Setelah 7 hari setiap perlakuan diberi penambahan 5 ml suspensi isolat jamur R.
solani ke dalam media tanah kecuali perlakuan kontrol negatif (K-). Penelitian ini menggunakan metode percobaan Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang terdiri dari 7 perlakuan dan 5 ulangan.
Tabel 3.10.1 Perlakuan uji potensi bakteri endofit pada tanaman jagung
No. Perlakuan
Variabel yang diamati adalah intensitas penyakit dan presentase pengurangan gejala serangan penyakit. Perhitungan intensitas penyakit dilakukan pada akhir pengamatan dan dihitung dengan rumus:
Keterangan:
I = Intensitas penyakit
ni = Jumlah tanaman yang terinfeksi pada setiap kategori serangan vi = Nilai numerik (skala) dari masing-masing gejala serangan N = Jumlah tanaman yang diamati
V = Nilai numerik (skala) tertinggi
Menurut Muslim et al. (2014), skala nilai pengamatan terhadap intensitas penyakit jamur R. solani pada kecambah tanaman jagung adalah sebagai berikut:
Skala Deskripsi
0 Tidak ada gejala penyakit
1 Lesi (luka) muncul pada batang sepanjang 1 mm 2 Lesi (luka) berwarna coklat gelap 2-10 mm 3 Lesi coklat gelap 10-25 mm
4 >25 mm, batang menjadi hitam dan busuk serta layu pada daun 5 Kecambah busuk menyeluruh dan mati
Persentase pengurangan gejala penyakit pada tanaman jagung dihitung menurut Suryanto et al. (2010), dengan rumus:
100%
Pengukuran tinggi kecambah dilakukan mulai dari pangkal batang yang tepat pada permukaan tanah sampai batas teratas, yaitu ujung daun yang sejajar dengan batang (Sitompul dan Guritno, 1995). Pengukuran dilakukan pada setiap perlakuan sebanyak lima ulangan. Pengukuran dilakukan pada 30 hari masa tanam. Pengukuran berat basah dan berat kering kecambah dilakukan pada akhir pengamatan.
Pengukuran berat basah yaitu tanaman dari masing-masing perlakuan ditimbang dengan menggunakan timbangan. Pengukuran berat kering dengan mengukur berat kecambah yang sudah dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 80oC selama 5 hari hingga didapatkan berat kering yang konstan.
3.12 Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan menggunakan ANOVA (Analysis of Variance) menggunakan SPSS 22. Jika terdapat perbedaan yang nyata dilanjutkan dengan uji DNMRT (Duncan’s New Multiple Range Test) pada taraf 5%.
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
BAB 4