A. Desain Penelitian Tahap I 1. Tempat dan Waktu Penelitian
Pengadaan sampel rimpang Z. zerumbet dan proses ekstraksinya dilakukan di UPT Balai Materia Medica, Batu, Jawa Timur. Uji sensitifitas Salmonella spp terhadap ekstrak Z. zerumbet dilakukan di Laboratorium Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang. Pengujian dilakukan Tanggal 1 Oktober sampai 30 Desember 2017.
2. Tujuan Penelitian
Penelitian Tahap I dilaksanakan untuk mengetahui potensi ekstrak etanol dari
Z. zerumbet dalam menghambat bakteri patogen Salmonella spp pada ayam broiler.
Pada tahapan ini dilakukan uji sensitifitas Salmonella spp serovar S. typhimurium dan S. enteritidis terhadap ekstrak etanol dari Z. zerumbet. Terdapat 3 percobaan yang dilakukan, yaitu uji Minimal Inhibition Concentration (MIC) dan Minimal
Bactericide Concentration (MBC) dengan metode pengenceran, difusi dan
kejernihan secara kuantitatif dengan spektrofotometer. Hasil penelitian Tahap I digunakan sebagai dasar pada penelitian Tahap II.
3. Percobaan: Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Z. zerumbet terhadap Salmonella spp.
a. Materi Penelitian 1) Isolat Mikroba
Isolat murni yang digunakan adalah Salmonella spp, terdiri atas serovar S.
enteritidis ATCC 31194 dan S typhimurium ATCC 23564 yang diperoleh dari
laboratorium Mikrobiologi Universitas Brawijaya, Malang, Jawa Timur. 2) Alat dan Bahan
Alat yang diperlukan terdiri atas toples bertutup, corong gelas, timbangan analitik, gelas ukur, botol, waterbath, erlemeyer, rotary evaporator, beaker glass,
shaker digital dan alkohol meter. Bahan yang diperlukan antara lain rimpang Z. zerumbet, bahan lain yang digunakan yaitu etanol, media MHA, MHB dan aquades
37 b. Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan adalah metode percobaan in vitro, RAL pola faktorial, faktor I adalah konsentrasi etanol, yaitu 45%, 70% dan 95%, sedangkan faktor II berupa konsentrasi ekstrak Z. zerumbet, yang terdiri atas 2,5%; 5%; 7,5% dan 10%. Data dianalisis dengan analisis varians (Anava), dan jika berpengaruh nyata dilanjutkan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT).
c. Prosedur Penelitian
Prosedur uji sensitifitas Salmonella spp terhadap ekstrak etanol dari Z.
zerumbet sebagai berikut:
1) Pembuatan Ekstrak Etanol Z. zerumbet
Proses pembuatan ekstrak etanol dari Z. zerumbet dilakukan dengan metode maserasi, dengan prosedur kerja sebagai berikut:
a) Ditimbang rimpang lempuyang gajah sebanyak 100 gram (pembuatan ekstrak etanol 45% dan 70%), 150 gram (pembuatan ekstrak etanol 95%)
b) Dilakukan pembasahan dengan pelarut etanol sebanyak 100 ml.
c) Serbuk yang telah dibasahi dengan pelarut dimasukkan ke dalam toples, diratakan dan ditambahkan pelarut etanol sampai terendam (pelarut yang digunakan minimal 2 kali berat atau lebih, yaitu 1 liter). Toples ditutup dengan rapat selama 24 jam, dan dishaker dengan shaker digital kecepatan 50 rpm. d) Ekstrak cair disaring dengan penyaring kain, dan ekstrak ditampung dalam
erlemeyer.
e) Hasil ekstrak cair diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator, diperlukan waktu 1 jam untuk evaporasi.
f) Ekstrak yang dihasilkan dievaporasi/diuapkan di atas water bath selama 2 jam. 2) Pemeriksaan KHM/MIC (Konsentrasi Hambat Minimum) metode mikrodilusi
(Dillution Tube) dan difusi a) Cara Mikrodilusi.
Membuat seri konsentrasi awal dari ekstrak etanol Z. zerumbet dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,75%, 3,37%, 1,65%, 0,32%. 0,15%, 0,52%, kontrol bahan dan kontrol mikroba, dengan volume 100 µL. Dibuat suspensi bakteri dari masing-masing dengan kepadatan 106 pada media cair, dengan cara komparasi memakai standart larutan Mc Farland 108, diencerkan kemudian dinokulasikan pada
38 masing-masing konsentrasi awal bahan uji dengan volume 100 µL. Sehingga diperoleh volume akhir 200µL dan konsentrasi perlakuan 50%, 25%, 12,5%, 6,75%, 3,37%, 1,65%, 0,32%. 0,15%, 0,52%,0,26%, kontrol bahan dan kontrol mikroba. Kemudian diinkubasi 1 x 24 jam suhu 37°C, dimixer sehingga homogen, dibaca perubahan kekeruhan atau endapan bakteri dengan Mikroplate reader dan ditentukan KHM dan KBM nya, menggunakan kurva standart yg menghubungkan antara angka pembacaan dan jumlah mikroba.
b) Cara Difusi
Disiapkan suspensi mikroba yang akan di tes pada media cair dengan kekeruhan setara dengan 0,5 mf. Dengan menggunakan lidi kapas steril ditanam secara goresan merata di permukaan media MHA dan dibiarkan beberapa saat. Meletakkan Blank Disk dengan pinset steril pada media MHA yang telah ditanami mikroba. Meneteskan bahan ekstrak uji pada Blank Disk sejumlah 10 µl, dilanjutkan inkubasi media pada suhu optimal, selanjutnya mengukur diameter zona yang tidak ditumbuhi koloni mikroba dalam satuan millimeter.
B. Desain Penelitian Tahap II 1. Tempat dan Waktu Penelitian
Pada Tahap II dilakukan pengujian karakterisasi simplisia dan standarisasi ekstrak etanol herba Z. zerumbet L. Smith. Pengujian parameter spesifik dan non spesifik dilakukan di beberapa laboratorium, antara lain : Laboratorium Nurisi, Peternakan, Fakultas Pertanian-Peternakan UMM, Laboratorium Terpadu Kedokteran UMM, Laboratorium Fitobiotik UPT Materia Medica, Depkes Jawa Timur, Laboratorium Perum Jasa Tirta II, Malang, Jawa Timur. Penelitian dilakukan Tanggal 20 November 2017 sampai Tanggal 25 Januari 2018.
2. Tujuan Penelitian
Penelitian Tahap II dilakukan untuk mengetahui karakterisasi simplisia dan standarisasi ekstrak etanol dari Z. zerumbet L. Smith. Pada tahap ini dilakukan pengujian terhadap parameter-parameter spesifik maupun tidak spesifik, antara lain identitas/ciri-ciri, organoleptik (rasa, bau, warna), kandungan zat terlarut dalam air dan etanol, dan kandungan fitobiotik dengan penapisan fitobiotik. Pengujian juga
39 dilakukan untuk mengetahui kandungan total abu, abu yang tidak larut dalam asam, BJ, kandungan air, pelarut yang tersisa, mikroba, aflatoksin dan logam.
3. Percobaan 1: Pengujian Identitas Ekstrak Z. zerumbet L. Smith, Organoleptik dan Kandungan Zat Terlarut dalam Solvent
a. Materi Penelitian Alat dan Bahan
Alat yang digunakan antara lain: logbook penelitian, alat tulis, literatur penunjang, panca indera, cawan, labu bersumbat, oven, mikroskup. Bahan yang dipakai adalah tanaman, simplisia dan ekstrak etanol dari Z. zerumbet (L.) Smith, kloroform, etanol 96%.
b. Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif berdasarkan hasil yang ditunjukkan secara kualitatif maupun kuantitatif.
c. Prosedur Penelitian
Pengujian terhadap identitas simplisia dilakukan secara makroskopik dan mikroskopik, untuk pengujian makroskopik dilakukan dengan pendeskripsian secara umum, termasuk lingkungan yang cocok untuk hidup tanaman, taksonomi, nama latin dan Indonesia. Pendeskripsian juga dilakukan pada bagian-bagian tanaman, antara lain: batang, daun, bunga, buah dan biji.
Pengujian secara mikroskopis dilakukan dengan pengamatan mikroskopis terhadap serbuk herba, mencakup fragmen-fragmen antara lain: epidermis, jaringan parenkim, stomata dan trachea.
4. Percobaan 2 : Pengujian Kandungan Kimia Ekstrak dengan Penapisan Fitobiotik
a. Materi Penelitian Alat dan Bahan
Pada percobaan ini alat yang digunakan antara lain tabung reaksi, penangas air, penyaring, kertas saring, cawan penguap, krus silikat, tanur, piknometer, destilator, labu ukur, cawan petri
Bahan yang diperlukan, yaitu etanol 70%, HCl 2 N, reagen Mayer, serbuk Magnesium (Mg), HCl pekat, aquabides, chloroform, H2SO4 pekat, FeCl3, petroleum eter, lapisan kapas, H2SO4 encer, toluene, aquades.
40 b. Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif berdasarkan hasil yang ditunjukkan secara kualitatif maupun kuantitatif.
c. Prosedur Penelitian
Pengujian penapisan fitobiotik terhadap ekstrak etanol Z. zerumbet L. Smith, terdiri atas beberapa uji identifikasi, yaitu alkaloid, flavonoid, saponin, triterpenoid, steroid (Nugroho, 2017).
1) Identifikasi Alkaloid
Alkaloid diuji dengan menggunakan tiga jenis reagen, yaitu Meyer, Dragendrouf dan Bouchardat, ketiganya diproduksi oleh Merck, Jerman. Prosedur pengujian adalah sebagai berikut, sebanyak dua mililiter ekstrak dicampur dengan aquadest sebanyak delapan milliliter, setelah dipanaskan sepuluh menit, kemudian dilakukan penyaringan, selanjutnya dilakukan test dengan menggunakan reagen Meyer dan Dragendrof, Bouchardat masing-masing sebanyak enam tetes. Hasil positif alkaloid apabila terdapat endapan putih pada pereaksi Meyer, endapan jingga pada pereaksi Dragendrof, dan endapan coklat pada perekasi Bouchardat.
2) Pemeriksaan Flavonoid
2 ml sampel ekstrak dan 8 ml aquadest dicampur, dilakukan pemanasan kira-kira 10 menit, penyaringan filtrat, beberapa tetes HCl ditambahkan, selanjutnya penambahan bubuk magnesium. Positif alkaloid apabila terbentuk warna merah muda sampai tua.
3) Pengujian Saponin
Mencampur 2 mililiter sampel dan 8 mililiter aquadest, pemanasan 10 mnt, penyaringan larutan hasil ditambah dua ml air panas, dilakukan pengocokan secara kuat. Adanya saponin ditandai dengan busa menetap, tidak lebih dari sepuluh menit. Buih akan hilang jika ditambahkan larutan HCl kira-kira satu tetes.
4) Pengujian Terpenoid
Mencampur dua ml ekstrak dengan delapan ml aquadest, kira-kira dipanaskan sepuluh menit, larutan yang dihasilkan disaring, selanjutnya ditetesi reagen Bouchardat sebanyak tiga tetes. Hasil positif adanya terpenoid jenis steroid, jika terbentuk warna hijau kebiruan, dan positif terpenoid jenis triterpenoid jika timbul warna orange atau jingga kecoklatan.
41 5) Identifikasi Tanin
Sebanyak 2 ml sampel ekstrak ditambahkan 8 ml aquadest yang telah dipanaskan selama ±10 menit, filtrate disaring dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi.ditambahkan 3 tetes FeCl3, hasil positif tannin apabila terbentuk warna coklat kehitaman, biru kehitaman, hijau kehitaman.
5. Percobaan 3 : Pengujian Komponen Kimia Ekstrak etanol Z. zerumbet dengan metode Gas Chromatography Mass Spectrometry (GC-MS)
a. Materi Penelitian Alat dan Bahan
Alat yang digunakan berupa Perkin Elmer GC-MS (Perkin Elmer Clarus 680 GC-Clarus SQ 8T MS) yang memiliki kolom kapiler Elite-5 MS 30 m × 0,25 mm × 25m ( 5% difenil, 95% dimetilpolisiloksan).
b. Tempat dan Waktu Penelitian
Analisis GC-MS dilaksanakan di Laboratorium Sentral Ilmu Hayati (LSIH) Universitas Brawijaya Malang.
c. Cakupan penelitian
Tahapan penelitian ini bertujuan untuk menganalisis komponen kimia ekstrak etanol dari Z. zerumbet dengan metode GC-MS.
d. Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif berdasarkan hasil yang ditunjukkan secara kualitatif.
e. Prosedur Penelitian
GC-MS dideteksi menggunakan sistem ionisasi elektron dengan energi ionisasi 70 eV. Pembawa gas dalam bentuk helium ultrapure digunakan dengan laju aliran konstan 1 mL / menit. Sumber ion, massa jalur transfer, dan suhu injektor masing-masing diatur pada 230 ° C, 250 ° C, dan 290 ° C. Suhu oven diatur antara 50 hingga 150 ° C pada 3 ° C / menit dan dalam kondisi isotermal selama 10 menit dan kemudian dinaikkan hingga 250 ° C pada 10 ° C / menit. Sampel encer (1/100, v / v dalam etanol) dari 1 wL disuntikkan secara manual dalam mode split 120. Pemindaian spektral massa berada dalam kisaran 45-450 m / z dengan keterlambatan pelarut 2 menit. Komponen ekstrak diidentifikasi berdasarkan perbandingan waktu
42 retensi GC relatif dan mass Spektrum dengan komponen dari NIST MS Search Library Software versi 2.0. Cat 10 ° C / mnt (Valle et al., 2016)
6. Percobaan 4 : Pengujian Parameter Non Spesifik Ekstrak Z. zerumbet a. Materi Penelitian
Alat dan Bahan
Alat yang diperlukan dalam percobaan ini antara lain: krus silikat, tanur, cawan, kertas saring, piknometer, destilator, labu alas bulat, penangas air, vortex, cawan petri, pipet tetes, incubator. Bahan yang digunakan antara lain: ekstrak Z.
zerumbet L. Smith, H2SO4 encer, toluene, aquades, Nutrient Agar, Potato Dextrose
Agar.
b. Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif berdasarkan hasil yang ditunjukkan secara kualitatif maupun kuantitatif.
c. Prosedur Penelitian
Pengujian parameter non spesifik terhadap ekstrak etanol Z. zerumbet SM. terdiri atas beberapa pengujian, antara lain: kandungan abu tak larut dalam asam, total abu, BJ, penetapan kandungan air, kadar pelarut yang masih tersisa, mikroba, Logam, dan aflatoksin/. Prosedur pengujian senyawa kimia tersebut sebagai berikut: 1) Kadar Abu Total
Menimbang satu gram ekstrak sebagai (W1), krus silikat yang dipijar sebagai (W0). Memasukkan ekstrak ke dalam krus silikat, dipijar dengan tanur, suhu ditingkatkan secara pelan sampai 600 ± 25oC, ditunggu hingga arang habis dan ditimbang sebagi (W2).
% kadar abu total = 𝑊2−𝑊0
𝑊1 × 100% W0 = gram cawan kosong
W1 = gram berat ekstrak awal
W2 = gram cawan dan ekstrak setelah pengabuan 2) Penentuan Kandungan Abu tidak Larut Asam
Pendidihan abu (hasil pengujian total kadar abu) menggunakan asam sulfat encer (25 ml) kira-kira 5 menit, komponen yang tidak larut asam dikoleksi, dilakukan penyaringan menggunakan kertas saring bebas abu, pembilasan residu
43 memakai air panas. Memasukkan abu dan sekaligus kertas saring ke dalam krus silikat. Selanjutnya, dengan tanur ekstrak dipijar secara pelan-pelan (meningkatkan suhu perlahan-lahan sampai 600 ± 25oC, sampai habis arangnya, selanjutnya dilakukan penimbangan (W2).
% kadar abu tidak larut asam =(𝐶 × 0,0076) − 𝑊0
𝑊1 × 100%
Keterangan : C : gram kertas saring W0 : gram cawan kosong W1 : gram ekstrak awal
W2 : gram cawan dan abu tak larut asam 3) Masa Jenis
Menimbang piknometer, dilakukan kalibrasi sebagai berat piknometer kosong (W0), penimbangan piknometer setelah diisi air dengan pendidihan suhu 25oC, sebagai berat piknometer dan air (W1). Ekstrak cair dengan suhu 20oC, dimasukkan dalam piknometer dan dipanasi hingga suhu 25oC, selanjutnya ditimbang sebagai berat piknometer dan ekstrak (W2).
d = 𝑊2−𝑊0 𝑊1−𝑊0
Keterangan : d : BJ
W0 : Berat piknometer kosong (gram) W1 : Berat piknometer + air (gram) W2 : Berat piknometer + ekstrak (gram)
4) Penetapan Kadar Air
Kadar air ditetapkan menggunakan metode destilasi toluene, dengan penjenuhan toluene menggunakan air, toluene jenuh dikocok, kemudian didiamkan, dilakukan pembuang lapisan air setelah terjadi pemisahan antara toluene dengan air. Ekstrak sebanyak 10 gram dimasukkan ke dalam labu (alas bulat), ke dalamnya ditambahkan toluena jenuh, kemudian dipanaskan kira-kira 100 menit, saat awal mendidih penyulingan mulai dilakukan, awalnya 2 tetes per detik, selanjutnya 4 tetes. Ditunggu toluene mendidih sempurna, dilanjutkan pemanasan sekitar 5 menit, kemudian didinginkan sampai mencapai suhu kamar. Setelah terjadi pemisahan
44 sempurna antara toluene dan air, selanjutnya dilakukan pembacaan volume air dan kadar air bisa dihitung dalam persen berdasarkan perbandingan dengan berat ekstrak semula. Dilakukan 3 kali percobaan (Saifudin et al., 2011).
5) Sisa Pelarut
Menimbang 2 gram ekstrak alkohol 30%, dilarutkan menggunakan air sampai volume 25 ml, selanjutnya masukkan ke labu destilasi dengan suhu 78,5o C, lakukan destilasi kira-kira 2 jam atau sampai tidak terjadi penetesan larutan Destilat ditambahkan air hingga volume 25 ml, dilakukan penetapan berat jenis cairan pada suhu 25oC. Dilakukan perhitungan persentase dalam volume dari etanol dalam cairan, diperlukan Table BJ dan kadar etanol yang tercantum dalam Farmakope Indonesia edisi IV (Saifudin et al., 2011).
6) Cemaran Mikroba
Labu ukur 10 ml diisi ekstrak 1 gram, ditambahkan aquades sampai 10 ml, pengenceran 10-1 ini dikocok hingga larut, selanjutnya dilakukan pengenceran 10-2 dan 10-3 (Saifudin et al., 2011).
a) Total Plate Count (TPC)
Sebanyak 1 ml ekstrak masing-masing pengenceran diletakkan dalam cawan, ditambahkan 5 ml NA yang dibuat cair pada suhu 45 oC, menggoyang sehingga sampel rata, dan dibiarkan sampai membeku. Masukkan cawan petri ke incubator suhu 35oC selama 24 jam, dengan posisi dibalik. Menghitung TPC, yaitu perkalian antara jumlah koloni dengan faktor pengenceran dalam satuan koloni/gram sampel (Saifudin et al., 2011).
b) Kapang dan Khamir
Sebanyak 5 ml media PDA, sesudah dipanaskan dengan suhu 45 oC dan berbentuk cair segera dituang ke dalam cawan petri, dibiarkan beku. Dari tiap pengenceran diambil 0,5 ml dipepet ke dalam cawan petri. Cawan petri digoyang secara pelan dan hati-hati sampai sampael merata pada media, selanjutnya diinkubasi selama tujuh hari. Melakukan pencatatan jumlah kapang per gram sampel (Saifudin
45 C. Desain Penelitian Tahap III :
1. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini merupakan percobaan in vivo pada ayam broiler, yang didasarkan atas hasil penelitian terbaik Tahap I dan Tahap II. Penelitian Tahap III terdiri atas 2 percobaan, percobaan dilakukan di kandang percobaan, clouse house,
Experimental Farm, Peternakan UMM. Pengujian laboratorium dilakukan di
Laboratorium Nutrisi, Peternakan, FPP dan Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran UMM. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret 2018.
2. Tujuan Penelitian
Penelitian ini untuk melaksanakan tujuan ketiga dan menjawab hipotesis ketiga, yaitu untuk mendapatkan potensi ekstrak etanol dari Z. zerumbet sebagai feed
additive untuk pengendalian Salmonelosis dan perbaikan kesehatan ayam broiler. 3. Percobaan 1 : Pengujian Dosis Infeksi Salmonella enteritidis
Melakukan percobaan in vivo berupa infeksi secara oral dengan Salmonella
spp hasil terbaik Tahap I, yaitu S. enteritidis dengan dosis bertingkat, yaitu 104, 106, 108, 1010 dan 1012 pada ayam broiler umur 10 hari dan diamati gejala klinis ayam selama 1 minggu pasca infeksi, gejala klinis yang diharapkan adalah yang menunjukkan gejala diare sedang.
4. Percobaan 2 : Uji potensi ekstrak etanol dari Z. zerumbet sebagai feed additive untuk pengendalian Salmonelosis
a. Materi Penelitian Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan di kandang pemeliharaan broiler antara lain pakan standar, yang disusun dengan formulasi sesuai kebutuhan. Bahan lain yang diperlukan adalah bekatul, jagung kuning, tepung ikan, konsentrat, minyak kelapa, bungkil kedelai, kapur, garam, ekstrak Z. zerumbet bentuk serbuk, vaksin dan air minum, sekam, koran, kardus. Alat yang diperlukan yaitu lampu, kabel, plastik, tempat pakan dan minum, timbangan, thermohygrometer, kalkulator dan alat tulis.
Materi penelitian terdiri dari adalah Day Old Chick (DOC) broiler berumur 1 hari, sebanyak 125 ekor, bobot badan awal berkisar antara 34 gram sampai 47 gram, dengan rataan 39,536 gram ± 2,481 dan masa pemeliharaan selama 35 hari. Vaksinasi ND dilakukan pada ayam umur 4, 17 dan 24 hari. Infeksi buatan menggunakan bakteri Salmonella spp. secara oral pada hari ke 10 dengan optical
46 density (OD) 1 x 1010 CFU, sedangkan serbuk ekstrak Z. zerumbet diberikan saat ayam umur 7 hari sampai 35 hari
Ekstrak Z. zerumbet bentuk serbuk diperoleh dari ekstrak yang tertinggi daya hambatnya terhadap S. enteritidis, dihasilkan dari penelitian Tahap I, yaitu ekstrak dengan konsentrasi 10% yang diekstrak dengan etanol 95%, sebagai pelarutnya. Proses pembuatan ekstrak Z. zerumbet serbuk ditampikan pada Gambar 7.
Gambar 7. Proses pembuatan ekstrak Z. zerumbet bentuk serbuk.
Pakan ayam dibuat untuk dua fase hidup ayam, yaitu periode starter dan
finisher, dengan formulasi pakan sebagaimana dapat dilihat pada Tabel 2.
Ekstrak lempuyang 10%
Ekstrak siap diberikan pada ayam sebagai PGP Rimpang Lempuyang Segar
Serbuk
Ekstrak lempuyang 100%
Pelarut etanol 95%
Penambahan Aquades
Serbuk ekstrak lempuyang
Oven suhu 400C + amilum
47 Tabel 2. Formulasi Ransum
Formulasi Ransum
Bahan Pakan Starter Finisher
Jumlah (%) Jumlah (%) Bekatul 0,6 0,4 Jagung kuning 59,22 65,11 Tepung ikan 2,8 2,31 Tepung tulang 1 2 Tepung daging 4,42 - Bungkil kedelai 29 27 Minyak kelapa 1,22 1,12 Kapur 0,35 0,5 Garam 0,5 0,5 Lysin 0,7 0,9 Metionin 0,19 0,16 Total (%) 100,00 100,00
Komposisi Zat-zat Makanan
ME (kkal/kg) 3000,00 3000,00 Protein (%) 23 20 Lemak (%) 4,00 4,00 Serat kasar (%) 3,55 3,47 Ca (%) 0,89 0,76 P (%) 0,42 0,36 Na (%) 0,15 0,15 ASAM AMINO: Arginin (%) 0,88 0,98 Histidin (%) 0,35 0,38 Isoleusin (%) 0,77 0,82 Leusin (%) 0,98 1,02 Lisin (%) 0,99 1,00 Metionin (%) 0,46 0,40 Fenilalanin (%) 0,76 0,82 Treonin (%) 0,66 0,69 Triptofan (%) 0,31 0,26 Valin (%) 1,23 1,09 b. Metode Penelitian
Penelitian menggunakan metode percobaan, Rancangan Acak Lengkap (RAL), terdiri 5 perlakuan, yaitu : T0 (ayam diberi pakan basal), T1 (ayam diberi pakan basal + infeksi Salmonella spp.), T2 (ayam diberi pakan basal + infeksi
Salmonella spp. + ekstrak Z. zerumbet 0,33% total pakan), T3 (ayam diberi pakan
48 diberi pakan basal + infeksi Salmonella spp. + ekstrak Z. zerumbet 1% total pakan). Setiap perlakuan diulang 5 kali dan setiap ulangan terdiri dari 5 ekor ayam.
c. Variabel, Cara Pengukuran dan Prosedur
Secara garis besar terdapat 4 variabel yang diukur pada penelitian Tahap III, yaitu variabel kesehatan yang diukur yaitu kesehatan intestinum, kesehatan darah, dan histopatologi organ visceral. Variabel performa yang diukur yaitu kecernaan, berat organ visceral dan indeks organ serta tampilan produksi.
Variabel Kesehatan
1) Variabel Kesehatan Intestinum
Variabel kesehatan intestinum yang diukur meliputi jumlah koloni
Salmonella spp, rasio antara tinggi villi dengan kedalaman kripta dan ketebalan
epithelium.
a) Penghitungan Koloni Salmonella enteritidis
Koloni S. enteritidis pada feses disampling pada hari ke 10, sesaat sebelum diinfeksi dan pada hari ke 28. Prosedur pengukuran jumlah koloni menggunakan metode hitungan cawan petri, sebagai berikut:
Sebanyak 1 ml suspensi bakteri diambil, diencerkan dengan menambah 9 ml PBS (larutan fisiologis) untuk membuat pengenceran 10-1, dari pengenceran 10-1 diambil 1 ml dan ditambahkan PBS untuk membuat pengenceran 10-2, dan seterusnya, membuat pengenceran 10-3, 10-4 sampai dengan 10-10. Bakteri selanjutnya dipindahkan dengan mikropipet ukuran 100 ml, dikocok menggunakan vortex supaya homogen. Sebanyak cawan petri kosong disiapkan dan diberi kode, disesuaikan tingkat pengenceran yang akan dituang. Media PDA dituang pada tiap cawan petri, selanjutnya cawan ditutup dan diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Dilakukan perhitungan jumlah koloni yang tumbuh, perhitungan total dengan mengalikan faktor pengencerannya. Data jumlah koloni S. enteritidis dianalisis menggunakan Analisis Ragam (Analysis of Variance/ANOVA), dan jika terdapat perbedaan dilanjutkan dengan Uji Wilayah Berganda Duncan (Duncan’s Multiple
49 b) Pengukuran (rasio tinggi villi dengan kedalaman kripta dan ketebalan epithelium)
dan Pengamatan Histopatologi Organ Viseral
Prosedur diawali dengan pemilihan jaringan intestinum yang terbaik. Setiap bagian intestinum, yaitu duodenum, jejunum dan ileum, diambil 3 segmen (proksimal, midle dan distal) masing-masing sepanjang 1 cm. Memasukkan jaringan ke dalam formalin 10% untuk fiksasi. Memproses jaringan menggunakan tex
processor kemudian mengeblok jaringan dengan paraffin, selanjutnya jaringan
dipotong menggunakan microtome dengan ketebalan 5µm. Melakukan deparafinisasi dengan meletakkan jaringan dalam oven selama 1-2 jam dengan suhu 600C, kemudian dimasukkan ke dalam xylol, masing-masing 15 menit. Mencelupkan ke dalam alkohol 96% diperkirakan tiga menit, kemudian dibilas menggunakan air mengalir durasi sepuluh menit. Dilakukan pengecatan dengan Hematoxylin-Eosin (Puspitasari, 2015).
Pembacaan slide preparat dilakukan dengan mikroskop cahaya dengan pembesaran 40 x. Pengukuran panjang villi dan kedalaman kripta dilakukan dengan software Scan Dot Slide Olyvia dengan satuan ukur µm (Puspitasari, 2015). Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif kuantitatif.
c) Penentuan Aktivitas Enzim dalam Intestinum Tenue
Penentuan aktivitas amilase, dengan cara 1 mL filtrate enzim hasil ekstraksi ditambahkan dengan 1 mL larutan substrat (soluble starch), kemudian diinkubasi selama 3 menit pada suhu optimum 30 ºC. Reaksi enzim dilanjutkan dengan penambahan 2 mL DNS (3.5 dinitro salicilic acid). Ditambahkan 20 mL aquades dan serapan diukur dengan Spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm. Aktivitas enzim α-amilase = C x 1/T x 1 unit/1mikromol
Keterangan: C = Konsentrasi maltosa per mL ekstrak enzim (mikromol), T = Waktu inkubasi (menit), 1 unit enzim α-amilase = besarnya aktivitas enzim yang dibutuhkan untuk membebaskan 1 mikromol maltosa per menit per mL enzim (Suarni dan Patong, 2007).
Penentuan aktivitas protease, diukur dengan menggunakan modifikasi metode Walter (1984) (Tabel 3.2). Sebanyak 100 ml ekstrak kasar protease ditambahkan 0,5 ml kasein 1 % (w/v) dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37
50 °C. Reaksi antara ekstrak kasar protease dan kasein dihentikan dengan penambahan asam trikloro asetat (TCA) 10 % dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 10 °C. Larutan reaksi selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 8.000 g selama 10 menit untuk kemudian dikoleksi supernatant. Kemudian larutan ditambahkan Na2CO3 0.5 M dan pereaksi Folling Ciocalteau (1:2) sebelum dihomogenkan dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Setelah inkubasi, absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 578 nm. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang membebaskan 1 µmol tirosin per menit pada suhu dan pH optimum (Suhartono dan Artika, 2017)
Tabel 3. Pengukuran Aktivitas Enzim Protease
Pereaksi Blanko (µL) Standar (µL) Sampel (µL)
Bufer Tris-HCl 0.2 M pH 8 500 500 500 Casein 1 % Enzim 500- 500- 500100 Aquades steril 100 - -Tirosin Standar (5 mM) - 100
-Diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 10 Menit Asam Trichloroasetat
10% 1000 1000 1000
Aquades steril - - 100
Enzim 100 100
-Inkubasi pada suhu 37 oC selama 10 Menit Sentrifuge 10.000 rpm selama 5 menit
Supernatan 750 750 750