METODE PENELITIAN
3.3 Hewan Percobaan
Hewan yang digunakan dalam percobaan ini adalah mencit jantan (Mus musculus L) strain DD Webster dewasa fertil berumur ± 3 bulan dengan berat badan 25-35 gram. Hewan dikondisikan selama lebih kurang satu minggu di laboratorium dengan diberi makanan pelet dan minuman air mineral yang sesuai, dibagi dalam 5 kelompok masing-masing terdiri dari 5 hewan uji yaitu:
a. Kelompok I (PO) = 5 ekor mencit jantan dewasa diberi larutan NaCl 0,9% secara oral selama 30 hari.
b. Kelompok II (P1) = 5 ekor mencit jantan dewasa diberi MSG 4 g/kg BB secara oral selama 30 hari.
c. Kelompok III (P2) = 5 ekor mencit jantan dewasa diberi MSG 4 g/kg BB disertai dengan pemberian vitamin C 0,26 g/kg BB secara oral selama 30 hari. d. Kelompok IV (P3) = 5 ekor mencit jantan dewasa diberi MSG 4 g/kg BB
disertai dengan pemberian vitamin E 0,026 g/kg BB secara oral selama 30 hari.
e. Kelompok V (P4) = 5 ekor mencit jantan dewasa yang diberi MSG 4 g/kg BB disertai dengan pemberian vitamin C 0,26 g/kg BB dan vitamin E 0,026 g/kg BB secara oral selama 30 hari.
3.4 Prosedur
Setelah 30 hari perlakuan, masing-masing hewan coba dikorbankan dengan cara dislokasi leher dan selanjutnya dibedah, selanjutnya dilakukan pengamatan sebagai berikut:
3.4.1. Pengambilan Sekresi Cauda Epididimis
Untuk mendapatkan sperma didalam sekresi cauda epididimis dilakukan sebagai berikut: Setelah 30 hari perlakuan, masing-masing hewan percobaan dikorbankan dengan cara dislokasi leher dan selanjutnya dibedah. Kemudian organ testis beserta epididimis sebelah kanan dan kiri diambil dan diletakkan kedalam cawan petri yang berisi NaCl 0,9%. Dibawah mikroskop cahaya bedah dengan perbesaran 400 kali cauda epididimis dengan cara memotong bagian proximal corpus epididimis dan bagian distal vas deferens. Selanjutnya epididimis dimasukkan kedalam gelas arloji yang berisi 1 ml NaCl 0,9%, kemudian bagian proximal cauda dipotong sedikit dengan gunting lalu cauda ditekan dengan perlahan hingga sekresi cairan epididimis keluar dan tersuspensi dengan NaCl 0,9%. Suspensi sperma dari cauda epididimis yang telah diperoleh dapat digunakan untuk pengamatan yang meliputi jumlah sperma dan morfologi sperma. (Suparni, 2009).
3.4.2 Pengamatan Jumlah Sperma
Pengamatan jumlah sperma dilakukan sebagai berikut:
Suspensi sperma yang telah diperoleh terlebih dahulu dihomogenkan. Selanjutnya diambil sebanyak 10 µl sampel dan dimasukkan ke dalam kotak-kotak hemositometer Improved Neubauer serta ditutup dengan kaca penutup. Dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali, hemositometer
diletakkan dan hitung jumlah sperma pada kotak/bidang A, B, C, D dan E. Hasil perhitungan jumlah sperma kemudian dimasukkan kedalam rumus penentuan jumlah sperma/ml suspensi sekresi cauda epididimis sebagai berikut:
Jumlah sperma = N/2 x 10 5
dimana N = jumlah sperma yang dihitung pada kotak A, B, C, D dan E. sperma/ml
Kamar hitung Improved Neubauer dapat dilihat pada Lampiran 4. 3.4.3 Pengamatan Morfologi Sperma
Untuk menentukan morfologi sperma diambil sperma dari cauda epididimis tersebut diatas dan dibuat sediaan hapus pada kaca objek, dikeringkan. Kemudian diberi alkohol 70% selama 15 menit, dikeringkan dan diberi pewarnaan Giemsa selama 15 menit. Setelah itu dibilas dengan air kran dan dikeringkan. Kemudiaan dengan mikroskop cahaya cahaya dihitung jumlah 100 sperma, ditentukan persentase sperma yang normal dan yang abnormal. Untuk mendapatkan hasil akhirnya, jumlah persentase sperma yang normal kiri dan kanan pada cauda epididimis dijumlahkan dan diambil rata-ratanya. Ciri sperma normal yaitu mempunyai bentuk kepala seperti kait pancing dan ekor panjang lurus, sedangkan sperma abnormal mempunyai bentuk kepala tidak beraturan, dapat berbentuk seperti pisang, tidak beraturan, atau terlalu bengkok, dan ekornya tidak lurus bahkan tidak berekor atau terdapat ekornya saja tanpa kepala (Suparni, 2009).
3.4.4 Pengamatan Histologis Testis
Pengamatan histologis testis dilakukan dengan cara pembuatan preparat dengan metode parafin yaitu:
a. Fiksasi
Mencit didislokasi dibagian leher dan dibedah. Diambil testis dan dicuci dengan larutan NaCl 0,9% kemudian difiksasi selama 1 malam dengan larutan bouin.
b. Washing (Pencucian)
Setelah difiksasi, testis dicuci dengan alkohol 70% dan direndam selama 1 malam.
c. Dehidrasi
Dehidrasi dilakukan dengan merendam testis dengan alkohol 70%, 80%, 96% dan alkohol absolut selama 1 jam dengan 2 kali pengulangan.
d. Clearing (Penjernihan)
Clearing dilakukan dengan merendam testis kedalam xylol selama 1 malam.
e. Infiltrasi
Infiltrasi dilakukan dengan merendam testis kedalam xylol yang berada di dalam oven pada suhu 56ºC selama 1 jam. Dilanjutkan dengan merendam testis kedalam parafin murni I, II, III masing-masing selama 1 jam pada suhu 56ºC.
f. Embedding (Penanaman)
Embedding dilakukan dengan meletakkan testis pada kotak berbentuk segi empat yang telah dipersiapkan sebelumnya sebagai cetakan. Setelah itu menuang perafin yang telah cair kedalam kotak tersebut, dan diberi label. Dibiarkan sampai dingin sehingga membentuk blok parafin dan
dimasukkan kedalam kulkas. Kemudian dilakukan penempelan blok-blok parafin pada holder yang terbuat dari kayu yang berbentuk persegi.
g. Cutting (Pemotongan)
Cutting dilakukan dengan memotong blok-blok parafin yang telah di holder pada mikrotum sehingga membentuk pita-pita parafin dengan ukuran ketebalan 6-10 µm.
h. Attaching (Penempelan)
Attaching dilakukan dengan mengambil beberapa pita parafin dengan skapel, kemudian diletakkan pada objek glass, dan dilcelupkan pada air dingin dan air hangat. Kemudian diletakkan diatas hotplate beberapa detik untuk meletakkan pita parafin pada objek glass.
i. Pewarnaan
Pewarnaan sediaan testis diwarnai dengan menggunakan Hematoxilin Eosin dengan cara sebagai berikut:
1. Deparafinasi, dilakukan dengan cara mencelupkan objek pada xylol sampai parafin habis kira-kira selama ± 15 menit.
2. Dealkoholisasi, dilakukan secara bertingkat dengan alkohol konsentrasi menurun, dengan alkohol absolut, alkohol 96%, alkohol 80%, dan alkohol 70%.
3. Pewarnaan dilakukan dengan cara objek glass dimasukkan kedalam larutan pewarna Hematoxilin Erlich selama 3-7 menit, dicuci dengan air mengalir ± 10 menit, dimasukkan kedalam alkohol 30%, 50%, dimasukkan kedalam larutan pewarna eosin 0,5% lalu kedalam alkohol 70% selama 1-3 menit, preparat dimasukkan berturut-turut kedalam
alkohol 70%, 80%, 96%, dan alkohol absolut, dikeringkan, selanjutnya preparat dimasukkan ke xylol.
j. Mounting
Mounting dilakukan dengan menutup preparat dengan canada balsam. Diusakan supaya tidak terdapat gelembung udara. Diberi label dan diamati dibawah mikroskop cahaya (Sinaga, 2011).