Ruang Lingkup Penelitian
Disertasi ini disusun berdasarkan empat topik penelitian yaitu: (1) Analisis kemiripan genetik (genetic similarity) tanaman jati Sulawesi Tenggara menggunakan marka mikrosatelit, (2) Analisis struktur genetik (genetic structure) populasi jati Sulawesi Tenggara menggunakan marka mikrosatelit, (3) Analisis aliran gen via serbuk sari (gene flow) dan biji (migration) pada tanaman jati Sulawesi Tenggara menggunakan marka mikrosatelit, dan (4) Analisis sistem perkawinan (mating system) tanaman jati Sulawesi Tenggara menggunakan marka mikrosatelit.
Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Biologi Molekuler Tanaman (PMB), Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Sampel daun dan benih dari tanaman jati diperoleh terutama dari hutan jati di kabupaten Muna dan Buton, Sulawesi Tenggara. Lama penelitian ini adalah 3 tahun, dimulai Mei 2003.
Bahan dan Metode Penelitian Bahan Tanaman
Populasi tegakan atau hutan jati yang dipilih adalah yang mempunyai level kerusakan atau gangguan terhadap tegakan jati tersebut akibat adanya aktivitas manusia. Untuk itu telah dipilih tiga lokasi populasi di Sulawesi Tenggara (Gambar 3.1 dan Tabel 3.1) dengan berbagai level gangguan yaitu dua populasi dari Kabupaten Muna dan satu populasi dari kabupaten Buton, sebagai berikut:
Lokasi Warangga terletak dekat kota Raha, Kabupaten Muna. Lokasi tanaman jati di Warangga ini relatif terjaga dari penebangan liar. Tanaman jati di lokasi ini ditanam sekitar tahun 1938. Lokasi ini sekarang dipertahankan dan mulai dipagari untuk dijadikan kebun bibit.
Lokasi Dolok terletak di Tampo, Kabupaten Muna. Tanaman jati di lokasi ini diperkirakan berumur 40 tahun. Lokasi ini relatif tidak terganggu oleh aktivitas manusia.
Lokasi Wadila terletak di Gunung Sejuk, Sampolawa, kabupaten Buton. Lokasi ini awalnya merupakan lokasi pertanaman jati yang pernah ditebang habis pada tahun 1958, kemudian dibiarkan sampai sekarang, dan pada lokasi ini kemudian tumbuh secara alami tanaman jati dan sekarang dikenal oleh masyarakat sebagai jati alam.
Tabel 3.1. Koordinat posisi geografis populasi jati dari Sulawesi Tenggara
Populasi Lintang Bujur Lokasi
Dolok 4.63 LS 122.70 BT Pulau Muna
Warangga 4.84 LS 122.65 BT Pulau Muna Sampolawa 5.53 LS 122.68 BT Pulau Buton
Pengambilan sampel tanaman berupa daun muda serta buah jati ditujukan untuk mempelajari keragaman genetik, struktur genetik serta aspek dinamika akibat adanya perpindahan informasi genetik berupa aliran gen (gene flow) melalui serbuk sari dan biji, serta untuk mempelajari sistem perkawinan (mating system) pada tanaman jati.
Gambar 3.1. Peta lokasi tempat pengambilan sampel populasi jati di Kabupaten Muna (Dolok dan Warangga) dan Kabupaten Buton (Sampolawa)
16 Material jaringan daun yang diambil untuk diekstrasi DNA nya adalah daun yang masih muda dan masih akan berkembang, kira-kira berukuran 8 - 12 cm dan diambil sebanyak 5 - 7 helai. Daun-daun tersebut kemudian diletakan di antara dua kertas yang dapat menyerap air kemudian dikeringkan pada ruangan ber AC (air-conditioning room) atau dikering anginkan. Material daun dapat juga disimpan dalam kantong ziplock yang berisi silika gel. Jaringan tersebut juga dapat diambil langsung dilapang menggunakan tabung microtube 1.5-2.0 ml yang mengandung buffer ekstraksi, namun dengan cara ini daun tersebut harus segera di gerus untuk diekstrasi atau dapat disimpan dalam waktu cukup lama sebelum diekstrak pada suhu -20oC.
Sedangkan benih diambil dengan cara memanen benih sebanyak 100-150 biji dari 15-20 pohon yang dianggap sebagai induk potensial, untuk masing- masing populasi. Benih-benih tersebut dikecambahkan untuk kemudian diisolasi DNA nya.
Prosedur Molekular dengan Marka Mikrosatelit
Isolasi DNA
Isolasi DNA daun jati dilakukan menggunakan metode CTAB. Sebanyak 1 gram daun jati muda ditambahkan nitrogen cair kemudian digerus dengan mortal, serbuk halusnya kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf . Untuk sampel sebanyak 0.3 g yang telah dimasukkan ke dalam tabung eppendorf tersebut kemudian ditambahkan 700 µL buffer CTAB (100 mM Tris-HCL pH 8.0, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% (b/v) CTAB), yang sebelumnya dipanaskan pada suhu 65oC dan 0.2% β-mercaptoethanol yang ditambahkan pada saat melakukan ekstraksi) dan digoyang-goyang supaya tercampur sempurna selama 30 detik. Sampel dalam buffer diinkubasi dalam penangas air pada suhu 65oC selama 30 menit dan sesekali dibolak-balik secara perlahan supaya buffer tercampur sempurna dengan sampel. Kemudian campuran tersebut dibiarkan pada suhu ruang selama beberapa menit untuk menurunkan suhu.
Untuk memisahkan larutan DNA dengan kotoran lainnya ditambahkan kloroform/isoamilalkohol (24:1) sebanyak 700 µL dan digoyang-goyang sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi pada kecepatan 15000 rpm selama 15
menit pada suhu ruang. Larutan bagian atas dipipet dan dimasukan ke dalam tabung yang baru kemudian ditambahkan 750 µL isopropanol dingin dan digoyang-goyang secara perlahan. Penambahan isopropanol dingin akan menyebabkan terbentuknya benang-benang DNA yang halus berwarna putih.
Pengendapan DNA dilakukan dengan sentifugasi pada kecepatan 15000 rpm selama 15 menit pada suhu ruang. Larutan bagian atas dibuang dan pellet dicuci dengan 200 µL ethanol 70% dengan cara mengoyang-goyang dan disentrifugasi 10000 rpm selama 10 menit kemudian ethanol 70% dibuang dengan cara dipipet kemudian pellet dikeringkan dengan cara membalikan tabung di atas kertas tisue dan divacum selama 10 menit sampai kering. Endapan DNA dilarutkan dengan 50 µL aquabidest dengan cara digoyang-goyang secara perlahan dan diinkubasi selama 30 menit atau satu malam pada suhu 37oC, sebelum digunakan disimpan pada -20oC , untuk analisa selanjutnya.
Penetapan Kualitas dan Kuantitas serta Visualisasi DNA.
Ukuran dan integritas DNA ditentukan berdasarkan elektroforesis gel agarose 1%. Pembuatan gel agarose 1% (b/v) dilakukan dengan cara melarutkan 1.0 g tepung agarose ke dalam 100 ml larutan buffer 1 x TAE (50 x TAE untuk 1 L mengandung 242 g Tris-base, 57.1 mL asam asetat glasial dan 100 mL 0.5 M EDTA-Na2 pH 8.0) kemudian dipanaskan dalam microwave selama 2 menit sampai agarose benar-benar larut. Larutan agarose diinkubasi selama 30 menit untuk menurunkan suhunya hingga mencapai 65oC. Kemudian dituangkan ke dalam cetakan gel yang sudah dipasang sisir dan dibiarkan sampai mengeras kira- kira 1 jam kemudian sisir dicabut dari gel secara perlahan. Gel yang telah mengeras dimasukan ke dalam bak elektroforesis dengan posisi sisir pada elektroda negatif dan ke dalam bak dimasukkan larutan buffer 1 x TAE sampai seluruh terendam.
Pengujian dilakukan dengan menggunakan 10 µL sampel DNA dilarutkan dengan 5 µL aquabides dan 5 µL loading buffer FDEU (90% delonized formamide, 0.1 M EDTA, 10% xylene cyanol, 10% bromophenol blue dan 8% (w/v) urea) dan dicampur merata. Elektroforesis DNA dilakukan dengan memasukan sebanyak 20 µL campuran DNA, aquabides dan loading buffer ke dalam lubang gel. Alat elektroforesis dihubungkan dengan power suplai listrik
18 model 1000/500 (BIORAD) pada tegangan konstan 75 volt, setelah pewarna pewarna mencapai jarak 1 cm dari pinggir bawah gel, power suplai listrik dimatikan (kira-kira selama 60 menit). Gel hasil elektroforesis direndam dalam larutan buffer 1 x TAE yang diberi 0.5 µg/mL etidium bromida sambil digoyang- goyangkan selama 20 menit kemudian dibilas dengan aquades selama 10 menit. Hasil elektroforesis dilihat dengan menggunakan transiluminator UV model T2202 (Sigma) untuk melihat pendaran DNA yang diberikan etidium bromida dan hasilnya difoto dengan menggunakan film Polaroid 667.
Amplifikasi DNA.
DNA diamplifikasi dengan menggunakan primer spesifik yang telah dikembangkan untuk jati dari proyect ICA4-2000-20053 (Tabel 3.2). Reaksi amplifikasi dilakukan dengan menggunakan 25 µL yang merupakan campuran larutan yang terdiri atas AmpliTaq DNA polimerase dan Stoffel fragment, dNTPs (masing-masing dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP 0.4 mM), 2.5 µg bovine serum albumin (BSA) dan buffer (3 mM MgCl2, 30 mM KCl dan 10 mM Tris, pH 8.3), 25 pmol primer, 2 µL DNA cetakan, dan 18 µL dH2O supaya mencapai volume akhir 25 µL dimasukkan ke dalam tabung eppendorf volume 500 µL dispin secara pelahan lahan supaya semua larutan tercampur sempurna. Minyak mineral ditambahkan keatas campuran larutan PCR dan DNA cetakan sebanyak 20 µL untuk menghindari penguapan selama berlangsungnya reaksi.
Tabel 3.2. Nama dan sekuen primer mikrosatelit berasal dari project jati TEAKDIV ICA4-2000-20053
No Primer Sekuen
1 AG04 for: 5’-AGAGGAGGTGCAGAGAGCAG-3’ rev: 5’-TAGCATTTGCTGCAAGCTGT-3’ 2 AG16 for: 5’-ATGCAAAAACGGAGTCTTGG-3’
rev: 5’-GGCAGAGCTATCTGAAGATCC-3’ 3 AGT10 for: 5’-TGCAGATAAAATGCTTGTGGA-3’
rev: 5’-CGCGAGAAATAGACCAGTGC-3’ 4 AC44 for: 5’-ACGCGGGTGTTAGGAAAATG-3’
rev: 5’-CCCATCAAACTGAGACAACCA-3’ 5 AC01 for: 5’-CATGTTGTATCATGAATGTG-3’
rev: 5’-CCTAGAAGAGAACCCCATGC-3’ 6 AG14 for: 5’-TCCACGACTCATGCAGGCTA-3’
rev: 5’-CCAACCAACCCTTTCAAATCC-3’ 7 ATC02 for: 5’-TCAAAGCTTGGCTACCACCA-3’
rev: 5’-GCCGAATTGGGACGACTTTA-3’ 8 AC28 for: 5’-ACGGCTATCAGACCAGCAGA-3’ rev: 5’-ATGCATGGCATGTTCTACCC-3’ 9 AAG10 for: 5’-GTGCACCAAGTCCGAGCAAT-3’
rev: 5’-CGAGAACCCGAACCTAACCA-3’ 10 CPIMS for: 5’-TTTCCCGTTATGTAGAGAATTGA-3’
rev: 5’-CCCAAATTGTGAACGATGAA-3’
Tabung berisi campuran larutan PCR dan DNA cetakan dimasukkan ke dalam mesin PCR. Reaksi amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan mesin PCR (Gene Amp PCR system 2400 Perkin-Elmer) dan diprogramkan untuk PCR awal pada suhu 95oC selama 5 menit satu siklus. Denaturasi DNA cetakan dari utas ganda menjadi utas tunggal pada suhu 95oC selama 1 menit, penempelan primer ke DNA cetakan pada suhu 36oC selama 1 menit dan pemanjangan pada 72oC selama 2 menit sebanyak 45 siklus, dan pemanjangan akhir pada suhu 72oC selama 5 menit satu siklus, dan pendinginan pada suhu 4oC selama tidak terhingga satu siklus.