Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari sampai dengan September 2008 di Bagian Biosistematika dan Ekologi Hewan Departemen Biologi, FMIPA, IPB.
Bahan
Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini berupa darah sapi perah FH. Jumlah keseluruhan sampel yang digunakan sebanyak 676 berasal dari 12 lokasi terdiri dari tujuh lokasi dari pusat pembibitan sapi perah pemerintah dan lima lokasi dari peternakan sapi perah rakyat (Tabel 2). Sampel dari pusat pembibitan sapi perah pemerintah meliputi: Balai Besar Inseminasi Buatan (BBIB) Singosari di Jawa Timur, Balai Inseminasi Buatan (BIB) Lembang di Jawa Barat, Balai Pembibitan Ternak Unggul (BPTU) Baturraden di Jawa Tengah, Balai Embrio Transfer (BET) Cipelang di Jawa Barat, dan Balai Pengembangan dan Pembibitan Ternak Sapi Perah (BPPT-SP) Cikole di Jawa Barat.
Sampel dari peternakan sapi perah FH rakyat meliputi: peternakan Fakultas Peternakan (FAPET) IPB, Koperasi Peternakan Susu Bandung Utara (KPSBU) Cilumber, KPSBU Pasar Kemis di Jawa Barat, Ngantang di Jawa Timur, Boyolali di Jawa Tengah, Lembang di Jawa Barat, dan Pondok Rangon di Jakarta. Sampel-sampel tersebut diambil pada tahun 2008 kecuali sampel dari BPTU Baturraden, Peternakan Rakyat Pondok Rangon, BIB Lembang dan Peternakan Rakyat Lembang, dikoleksi berturut-turut pada tahun 2002, 2004, 2006 dan 2007.
Cara pengambilan sampel. Darah diambil dari vena jugularis dan sebagian dari vena koksigalis. Sebanyak 1 sampai 2 ml darah diambil menggunakan siring 10 ml berukuran 21 G X 1 ½” dan vaccutainer yang berheparin dan tidak berheparin. Sampel darah yang diambil berupa darah total (sel darah dan plasma darah) dan koagulan (sel darah) (Tabel 2).
Tabel 2 Sampel darah yang digunakan dalam penelitian
No. Lokasi Tahun
Koleksi
Jenis kelamin
Jumlah
sampel Tipe sampel Pusat Pembibitan:
1 BBIB Singosari 2008 ♂ 32 darah total
2 BIB Lembang 2006 ♂ 30 darah total
3 BPTU Baturraden 2002 ♀ 97 sel darah putih
4 BET Cipelang 2008 ♀ 57 Koagulan
5 BPPT-SP Cikole 2008 ♀ 88 darah total
Peternakan Rakyat:
6 FAPET IPB 2008 ♀ 17 darah total
7 KPSBU Cilumber 2008 ♀ 98 darah total
8 KPSBU Pasar Kemis 2008 ♀ 95 darah total
9 Boyolali 2008 ♀ 49 darah total
10 Ngantang 2008 ♀ 47 darah total
11 Lembang 2007 ♀ 34 darah total
12 Pondok Rangon 2004 ♀ 32 koleksi sampel dalam bentuk DNA
Jumlah Total 676
Perlakuan awal sampel darah sebelum ekstraksi. Seluruh sampel koleksi tahun 2008 ditambah etanol absolut sebanyak dua kali volume darah kecuali sampel dari BET Cipelang dan FAPET IPB. Etanol absolut ditambahkan dengan cara berangsur-angsur sambil dikocok, sehingga sel-sel darah terselubungi oleh alkohol dengan tujuan agar darah tidak membusuk.
← Darah yang diambil dari Peternakan FAPET IPB langsung ditambah Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) dan dimasukkan dalam tabung tanpa heparin. Hal ini dilakukan karena lokasi pengambilan dekat dengan laboratorium, sehingga dapat segera dilakukan isolasi DNA. Sebelum ditambah etanol absolut, sampel ditambah NaCl 0.2% kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3 500 rpm selama 10 menit. Setelah supernatan dibuang, dilakukan penambahan etanol absolut sebanyak dua kali volume darah (konsentrasi etanol tidak kurang dari 50%) kemudian disimpan pada suhu ruang (Farajallah et al. 1998).
Sampel darah dari BET berupa gumpalan darah yang telah diambil serumnya. Serum digunakan untuk analisis penyakit oleh pihak BET. Sampel
berupa gumpalan darah tersebut disimpan dalam kotak es untuk penyimpanan sementara. Sampel ditambah etanol absolut sebanyak dua kali volume darah. Penambahan etanol dilakukan agar total konsentrasi etanol tidak kurang dari 50% untuk penyimpanan sampel dalam waktu yang lama.
Penyimpanan sampel permanen. Volume seluruh sampel darah diseragamkan kemudian ditambah etanol absolut sebanyak dua kali volume darah, sehingga total konsentrasi etanol tidak kurang dari 50% (Smith et al. 1987) kemudian ditambah 1 mM EDTA. Sampel selanjutnya dikocok agar alkohol tersebar merata di dalam tabung. Sampel kemudian disimpan pada suhu ruang (25.°C). Penyimpanan darah semacam ini dapat bertahan dalam jangka waktu yang lama.
Metode
Ekstraksi DNA
Isolasi molekul DNA total menggunakan DNA isolation Mini Kit for fresh blood (Geneaid). Ada empat tahapan sebagaimana tertera pada manual kit, yaitu: lisis, pengikatan, pencucian dan pengendapan DNA. Modifikasi dilakukan pada tahapan lisis DNA. Sampel yang disimpan dalam etanol dicuci sebanyak dua kali menggunakan air suling untuk membuang etanol sebelum menggunakan kit. Sebanyak 200 μl sampel darah diambil dan dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml, kemudian ditambahkan air suling sebanyak 800 μl, selanjutnya disentrifugasi 5.000 rpm selama 10 menit.
Endapan sel yang diperoleh dilarutkan dalam bufer 1x sodium chloride-Tris- EDTA (STE) (0.5 M sodium; 0.2 μM Tris-HCl; 0.02 M EDTA; pH 8.0), kemudian dilisis dengan proteinase-K dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 56 °C (Farajallah et al. 1998). Selain menggunakan proteinase-K, digunakan juga
Sodium Dodecyl Sulfate 1% (SDS), kemudian diinkubasi suhu 70 °C selama 10 menit. Tahapan selanjutnya mulai dari tahapan kedua sampai akhir mengikuti petunjuk di manual kit.
Sampel Pool DNA
Metode untuk menentukan genotipe gen ASS dan gen UMPS adalah PCR-RFLP. Sebanyak 676 sampel dipakai untuk mengidentifikasi genotipe gen ASS dan 483 sampel untuk gen UMPS. Setiap 6 sampai 10 sampel DNA hasil ekstraksi dengan konsentrasi terukur dimasukkan ke dalam satu tabung 1.5 ml. Masing-masing sampel diambil 10 μl kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3 500 rpm selama 1 menit, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 °C selama satu jam. Kumpulan DNA dalam tabung 1.5 ml ini disebut dengan sampel pool DNA (Sham
et al. 2002). Jika dalam 1 sampel pool DNA diketahui ada alel mutan maka anggota sampel pool DNA diperiksa satu persatu.
Amplifikasi Gen
Amplifikasi gen ASS dan gen UMPS menggunakan mesin PCR Thermal Cycler MP4 (TaKaRa). Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen ASS adalah F:GTG TTC ATT GAG GAC ATC, dan R:CCG TGA GAC ACA TAC TTG (Dennis et al. 1989) dengan suhu penempelan 61 °C. Amplifikasi gen UMPS menggunakan primer F: GCA AAT GGC TGA AGA ACA TTC TG, dan R: GCT TCT AAC TGA ACT CCT CGA GT (Schwenger et al. 2006) dengan suhu penempelan 60–61 °C. Campuran untuk mengamplifikasi gen ASS dan UMPS terdiri dari 10-100 ng DNA sapi FH, masing-masing primer sebanyak 1 μM, dNTP mix 120 μM, MgCl2 100 μM dan Taq polymerase RBC 1 unit beserta
bufernya.
Kondisi PCR untuk amplifikasi gen ASS dalam mesin TaKaRa yaitu pradenaturasi pada suhu 94 °C selama 5 menit yang dilanjutkan dengan 30 siklus (denaturasi 94 °C selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada suhu 61 °C selama 1 menit, ekstensi DNA pada suhu 68 °C selama 5 detik) dan diakhiri dengan pemanjangan akhir DNA pada suhu 72 °C selama 7 menit. Kondisi PCR untuk amplifikasi gen UMPS dengan kondisi PCR untuk amplifikasi gen ASS secara keseluruhan hampir sama hanya berbeda pada suhu penempelan. Suhu penempelan yang digunakan untuk amplifikasi gen UMPS dapat berkisar dari suhu 60 °C sampai dengan 61 °C.
Pemotongan Produk PCR dengan Enzim Restriksi
Pemotongan gen ASS. Produk PCR dipotong dengan enzim Ava II (Fermentas) yang mampu mengenali alel normal gen ASS (Patel et al. 2006). Campuran untuk memotong 2 μl produk PCR yaitu: 3 unit enzim Ava II; 0.4 μl bufer; 0.3 μl air suling steril. Enzim memotong produk pada suhu 37 °C selama satu malam (± 18 jam) dalam inkubator.
Pemotongan gen UMPS. Produk PCR tunggal dipotong dengan enzim Ava
I (Fermentas) yang mampu mengenali alel normal gen UMPS (Rahimi et al. 2006). Campuran untuk memotong produk PCR gen UMPS mempunyai volume yang sama dengan campuran yang digunakan untuk memotong produk gen ASS. Enzim Ava I memotong produk pada suhu 37°C selama 3 jam hingga satu malam dalam inkubator.
Visualisasi produk PCR
Visualisasi produk PCR dan hasil restriksi dilakukan menggunakan metode
Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) 6% yang dilanjutkan dengan pewarnaan perak (Tegelström 1986) yang dimodifikasi oleh Farajallah et al. (1998). Elektroforesis dijalankan pada tegangan 180 mV selama 30 menit dalam bufer 1x TBE (0.5 M Tris; 0.65 M asam borat; 0.02 M EDTA).
Analisis Data
Frekuensi alel dihitung dengan menggunakan rumus Nei (1987), yaitu: xi = (2nii + nij)
2n
xi = frekuensi alel Ai
nii = jumlah individu bergenotipe AiAi
nij = jumlah individu bergenotipe AiAj