2. TINJAUAN PUSTAKA 1 Bakteri Asam Laktat sebagai Probiotik 1 Bakteri Asam Laktat sebagai Probiotik
3.3 Metode Penelitian
a) Tahapan penelitian
Tahap pelaksanaan penelitian dan ringkasan percobaan dapat dilihat dalam matriks di bawah ini (Gambar 3).
TAHAP 1
TAHAP 2
TAHAP 3
TAHAP 4
Gambar 3 Diagram alir proses penelitian Rekonstitusi
suhu 50 °C
4 isolat BAL palingtahan suhu rekonstitusi (T=50 °C)
11 isolat BAL asal ASI
(menghambat EPEC K1.1>1siklus log) (Hartanti 2010) Analisis:
Total BAL sebelum dan sesudah rekonstitusi
4 isolat BAL palingtahan suhu rekonstitusi (T=50 °C) Uji Kompetisi BAL & C.sakazakii
YRC3a pada susu formula
Analisis:
Total BAL sebelum dan sesudah kompetisi 24 jam; analisis pH 2 isolat BAL yang mampu berkompetisi dan
menghambat C.sakazakii YRC3a
BAL kering beku Isolat terpilih tahap 2
Produksi biomassa sel basah + kriogenik laktosa 10% (b/v)
Pembekuan
Biomassa sel (T= -22 °C) Analisis:
Total BAL sebelum dan sesudah pembekuan dan sesudah pengeringan beku Pengeringan beku kultur BAL
(T= -50 °C; P= 0,01 Mpa; t= 48 jam
BAL kering beku
Uji kompetisi BAL dan C.sakazakii YRC3a pada suhu rekonstitusi 50, 60 & 70 ºC selama hang time 0, 2, 4, 6 dan 8 jam pada susu formula;
a)
BAL; b) C.sakazakii YRC3a; dan c) BAL& C.sakazakii YRC3a
Analisis: Total BAL, C.sakazakii YRC3a, pH, dan suhu C.sakazakii YRC3a
Penelitian ini terdiri dari 4 tahap. Tahap pertama bertujuan untuk menapis isolat BAL asal ASI yang memiliki ketahanan terhadap suhu rekonstitusi 50 ºC. Rekonstitusi dilakukan pada isolat BAL asal ASI yang telah disentrifugasi (biomassa sel bakteri). Pada tahap ini dilakukan analisis total BAL sebelum dan sesudah rekonstitusi. Selanjutnya dipilih 4 isolat BAL yang paling tahan suhu
rekonstitusi. Tahap kedua yaitu kompetisi isolat BAL asal ASI dengan
C. sakazakii YRC3a dalam susu formula rekonstitusi. Tahap ini bertujuan untuk menapis isolat BAL asal ASI yang memiliki kemampuan untuk berkompetisi dan menghambat pertumbuhan C. sakazakii YRC3a pada susu formula rekonstitusi. Pada tahap ini dilakukan penghitungan jumlah bakteri pada masing-masing media selektif; BAL media MRSA-AA dan C. sakazakii YRC3a pada media TSAYE-SC pada jam ke-0 dan setelah kompetisi jam ke-24. Analisis pH pada tahap ini juga dilakukan namun pada set yang terpisah.
Tahap ketiga mempelajari sintas BAL selama proses pengeringan beku (freeze-drying). Tujuan tahap ini adalah untuk melihat sintas isolat BAL yang paling tahan terhadap proses pengeringan beku (freeze drying). Pengeringan beku dilakukan pada dua isolat terpilih tahap 2. Pada tahap ini dilakukan analisis viabilitas BAL sebelum pembekuan, setelah pembekuan dan setelah pengeringan beku.
Penelitian tahap keempat adalah kompetisi BAL dan C. sakazakii YRC3a pada susu formula dengan berbagai suhu rekonstitusi yaitu 50, 60, dan 70 °C. Tahap keempat bertujuan untuk melihat kompetisi isolat BAL asal ASI yang telah dikering bekukan dengan C. sakazakii YRC3a selama hang time 0, 2, 4, 6, dan 8 jam. Pada tahap ini dilakukan penghitungan jumlah BAL dan C. sakazakii
YRC3a yang diinokulasikan pada susu formula. Penghitungan jumlah masing-masing bakteri dilakukan menggunakan media selektif BAL yaitu media
MRSA-Acetic acid dan C. sakazakii YRC3a pada media TSAYE-Sodium cloride
(perbandingan BAL dengan C. sakazakii YRC3a 108: 103). Analisis pH dan suhu dilakukan pada set terpisah.
Tahapan-tahapan penelitian, hasil yang diharapkan dan ringkasan penelitian, disajikan pada Tabel 3 dan 4.
Tabel 3 Tahap penelitian, tujuan, dan hasil yang diharapkan
Tahap Penelitian Tujuan Hasil yang Diharapkan
1. Penapisan BAL berdasarkan sintas selama rekonstitusi susu formula pada suhu 50 oC
Menentukan isolat BAL yang akan dipilih untuk digunakan pada penelitian
Mengetahui jenis isolat BAL yang tahan terhadap suhu rekonstitusi 50 °C
Isolat BAL yang tahan suhu rekonstitusi 50 °C
2. Kompetisi isolat BAL asal ASI dengan C. sakazakii YRC3a dalam susu formula rekonstitusi
Menentukan isolat BAL yang akan dipilih untuk
dikompetisikan dengan
C. sakazakii YRC3a
Mengetahui jenis isolat BAL yang mampu berkompetisi dan
menghambat
C. sakazakii YRC3a
Isolat BAL yang mampu berkompetisi dan menghambat
C. sakazakii YRC3a
3. Sintas BAL selama proses pengeringan beku (freeze-drying)
Menentukan isolat BAL yang akan dipilih untuk digunakan pada uji kompetisi tahap 4
Mengetahui jenis isolat BAL yang tahan terhadap proses pengeringan beku
Isolat BAL yang memiliki viabilitas sel tetap tinggi selama pengeringan beku
4. Kompetisi BAL dan C. sakazakii YRC3a pada susu formula dengan berbagai suhu rekonstitusi
• Melakukan uji kompetisi
BAL dan C. sakazakii
YRC3a pada suhu rekonstitusi 50, 60, dan 70 °C
• Penghitungan jumlah
BAL dan C. sakazakii
YRC3a yang
ditumbuhkan pada media
selektif selama hang
time (0, 2, 4, 6, dan 8) jam
• Pengukuran pH dan suhu
selama hang time (0, 2, 4, 6, dan 8) jam Melihat kemampuan BAL untuk bekompetisi dengan C. sakazakii YRC3a • Melihat pertumbuhan
BAL dan C.sakazakii
YRC3aselama Hang
time
• Melihat perubahan pH
dan suhu selama hang
time (0, 2, 4, 6, dan 8) jam
BAL yang tahan terhadap suhu rekonstitusi dan
menghambat C. sakazakii
YRC3a
• BAL yang tahan setelah
hang time, sedangkan
C. sakazakii YRC3a diharapakan mengalami penurunan jumlah atau terhambat
• Terjadi Perubahan pH yang
semakin rendah seiring dengan lamanya waktu
hang time, yang mengindikasikan BAL tetap bertahan pasca rekonstitusi dan selama
hang time dan perubahan suhu
Tabel 4 Ringkasan percobaan dari setiap tahap penelitian
Penelitian Faktor-faktor Pengamatan atau Analisis
1. Penapisan BAL berdasarkan sintas selama rekonstitusi susu formula pada suhu 50 oC
Menentukan isolat BAL yang akan dipilih untuk digunakan pada penelitian
Penggunaan suhu rekonstitusi
Total bakteri BAL yang masih bertahan sebelum dan sesudah rekonstitusi
2. Kompetisi isolat BAL asal ASI dengan C. sakazakii YRC3a dalam susu formula rekonstitusi
Menentukan isolat BAL yang akan dipilih untuk
dikompetisikan dengan
C. sakazakii YRC3a
Perubahan nilai pH dan jumlah total BAL setelah kompetisi
Total bakteri C. sakazakii
YRC3a setelah kompetisi
3. Sintas BAL selama proses pengeringan beku (freeze-drying)
Menentukan isolat BAL yang akan dipilih untuk digunakan pada uji kompetisi tahap 4
Proses pembekuan dan pengeringan beku
Total bakteri BALyang
masih bertahan sebelum dan
sesudahproses pengeringan
beku
4. Kompetisi BAL dan C. sakazakii YRC3a pada susu formula dengan berbagai suhu rekonstitusi
• Melakukan uji kompetisi
BAL dan C. sakazakii
YRC3a pada suhu rekonstitusi 50, 60, dan 70 °C
• Penghitungan jumlah BAL
dan C. sakazakii YRC3a yang ditumbuhkan pada media selektif selama
hang time (0, 2, 4, 6, dan 8) jam
• Pengukuran pH dan suhu
selama hang time (0, 2, 4, 6, dan 8) jam •Penggunaan suhu rekonstitusi yang semakin meningkat •Lamanya hang time •Lamanya hang time
•Penurunan log BAL dan
C. sakazakii YRC3a sebelum dan setelah rekonstitusi
•Melihat pertumbuhan BAL
dan C. sakazakii YRC3a
selama hang time
•Perubahan nilai pH dan
suhu pasca rekonstitusi dan
selama hang time
b. Prosedur Kerja
1) Penapisan bakteri asam laktat berdasarkan sintas selama rekonstitusi
susu formula pada suhu 50 oC (Modifikasi Meutia 2009; Fitriyah 2011)
Rekonstitusi dilakukan pada suhu 50 °C untuk mendapatkan isolat BAL asal ASIyang paling tahan terhadap suhu rekonstitusi 50 °C, untuk diikutsertakan pada tahap kedua. Penapisan dilakukan terhadap 11 jenis isolat BAL asal ASI
yang memiliki kemampuan menghambat E. coli entero patogenik K.1.1 ≥ 1 siklus
log (Hartanti 2010). Isolat bakteri asam laktat ditumbuhkan pada media MRSB 10 mL masing-masing sebanyak 6 tabung reaksi, kemudian diinkubasi sampai akhir fase log yaitu selama 24 jam pada inkubator suhu 37 °C. Dari dua tabung MRSB yang telah ditumbuhi sel BAL diambil 1 mL dan dilakukan pengenceran dengan media pengencer KH2PO4 9 mL. Serial pengenceran dilakukan untuk menghitung jumlah BAL setelah 24 jam inkubasi. Biomassa sel pada 4 tabung MRSB tersisa kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit sehingga didapat biomassa sel basah. Selanjutnya biomassa sel basah tersebut dicuci dengan Buffer Posphate Saline (BPS). Pelet sel dari 4 tabung masing-masing disuspensikan ke dalam 10 mL larutan buffer steril. Selanjutnya masing-masing sebanyak 0,2 mL suspensi BAL (biomassa sel basah) diinokulasikan pada 2,88 gram susu bubuk formula. Rekonstitusi dilakukan dengan air steril suhu 27 °C sebagai kontrol dan 50 °C hingga volumenya 20 mL di dalam erlenmeyer 50 mL. Jumlah BAL dalam susu bubuk formula rekonstitusi diperkirakan sekitar 107 CFU/mL. Jumlah BAL awal (kontrol) dan jumlah BAL akhir (rekonstitusi suhu 50 °C) ditentukan melalui penghitungan dengan metode tuang pada media MRSA. Selisih log10 antara jumlah koloni awal dan jumlah koloni akhir merupakan besar penurunan jumlah bakteri.
2) Kompetisi isolat BAL asal ASI dengan C. sakazakii YRC3a dalam susu
formula rekonstitusi (Modifikasi Meutia 2008; Fitriyah 2011)
Isolat BAL ditumbuhkan pada media MRSB 10 mL sebanyak 4 tabung reaksi, kemudian diinkubasi sampai akhir fase log yaitu selama 24 jam pada inkubator pada suhu 37 °C. Dari dua tabung MRSB yang telah ditumbuhi sel BAL diambil 1 mL dan dilakukan pengenceran dengan media pengencer KH2PO4 9 mL. Serial pengenceran dilakukan untuk menghitung jumlah BAL setelah 24 jam inkubasi. Biomassa sel pada 2 tabung MRSB tersisa kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit sehingga didapat biomassa sel basah. Selanjutnya biomassa sel basah tersebut dicuci dengan buffer posphate saline (BPS). Pelet sel dari 2 tabung masing-masing disuspensikan ke dalam 10 mL larutan buffer steril. Pengenceran dengan media pengencer bufer posfat 9 mL dilakukan sehingga diperoleh jumlah BAL
sekitar 108 CFU/mL. Hal yang sama juga dilakukan pada C. sakazakii
YRC3a, bakteri ini ditumbuhkan pada media TSB 10 mL, selanjutnya diinkubasi sampai akhir fase log yaitu selama 18 jam pada inkubator suhu 37 oC. Pengenceran dengan media pengencer bufer posfat 9 mL dilakukan sehingga diperoleh hasil penghitungan C. sakazakii YRC3a setelah 18 jam inkubasi. Selanjutnya terhadap bakteri C. sakazakii YRC3adilakukan kembali pengenceran dengan media pengencer bufer posfat sehingga diperoleh jumlah bakteri sekitar 104 CFU/mL (supaya jumlah C. sakazakii YRC3a pada susu formula rekonstitusi sebesar 103 CFU/mL).
Masing-masing sebanyak 2 mL suspensi BAL (jumlah 108 CFU/mL) dan 2 mL suspensi C. sakazakii YRC3a (jumlah 104 CFU/mL) diinokulasikan ke
dalam 2,88 gram sampel susu formula pada set yang sama. Takaran susu formula disesuaikan dengan prosedur penyajian yang tertera pada kemasan. Selanjutnya susu formula yang telah mengandung BAL dan C. sakazakii YRC3a direkonstitusi dengan menggunakan air minum dalam kemasan yang telah disterilkan dengan menggunakan suhu 27 oC sebagai kontrol dan 50 oC hingga volumenya 20 mL di dalam erlenmeyer 50 mL. Jumlah masing-masing bakteri pada susu bubuk formula rekonstitusi diperkirakan 108 CFU/mL untuk BAL dan 103 CFU/mL untuk C. sakazakii YRC3a.
Penghitungan jumlah bakteri (BAL dan C. sakazakii YRC3a) dilakukan dengan metode tuang pada masing-masing media selektif. BAL pada media
MRSA-AA (media selektif yang mengandung asam asetat glasial) dan
C. sakazakii YRC3a pada media TSAYE-SC (media selektif yang mengandung
yeast extract dan sodium klorida). Penghitungan jumlah masing-masing bakteri dilakukan pada jam ke-0 dan setelah kompetisi jam ke-24, sehingga diperoleh data jenis BAL yang paling efektif untuk berkompetisi dan menghambat patogen target.
3) Sintas BAL selama proses pengeringan beku (freeze-drying)
(Puspawati etal. 2010)
Sebelum proses pengeringan beku dilakukan produksi biomassa sel BAL. Biomassa BAL dibuat dengan menggunakan media MRSB. Pada medium yang telah steril diinokulasi kultur BAL yang telah disegarkan sebanyak 10% kemudian
diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Kultur kerja selanjutnya dipanen dan sentrifugasi pada kecepatan 1000 rotary per minute (rpm) selama 10 menit. Supernatan dipisahkan sehingga diperoleh biomassa basah. Berikut di bawah ini (Gambar 4) proses pembuatan biomassa basah dan proses pengeringan BAL (Gambar 5). Proses pengeringan beku terhadap isolat terpilih dilakukan dengan penambahan bahan pelindung (kriogenik) laktosa dengan konsentrasi 10% (b/v) dengan perbandingan biomassa basah dengan kriogenik adalah 1:10 (biomassa ditambah dengan 10 mL larutan laktosa steril). Isolat yang telah ditambahkan bahan pelindung dalam bentuk larutan disimpan selama 1 jam pada suhu 23 ºC dengan tujuan untuk memungkinkan terjadinya difusi bahan pelindung ke dalam sel, selanjutnya dibekukan pada suhu -20 ºC selama 12 jam dan kemudian
dikeringkan dengan alat freeze drier merk Labconco pada kondisi -50 ºC; 0,01 Mpa selama 2 hari.
Gambar 4 Proses pembuatan biomassa basah
Gambar 5 Proses pembuatan biomassa kering Medium MRS Broth
Sterilisasi (T=121 ºC, t=15 menit
Inokulasi isolat BAL sebanyak 10%
Inkubasi (T= 37 ºC t=16-20 jam)
Sentrifugasi (1000 rpm, t= 10 menit)
Biomassa Basah
Biomassa Basah
Penambahan larutan Laktosa 10% (b/v) (1:10)
Pembekuan (T= -20 ºC t=12 jam) Pengeringan beku (T= -50 ºC; P= 0,01 Mpa; t= 24 jam) Biomassa Kering Uji viabilitas
Viabilitas BAL dianalisis dengan melakukan penghitungan jumlah total BAL sebelum pembekuan (sel+kriogenik), setelah pembekuan, dan setelah pengeringan beku. Sebelum proses pengeringan beku dilakukan penghitungan jumlah BAL untuk mengetahui jumlah bakteri awal (sebelum penyalutan dengan kriogenik).
4) Kompetisi BAL dan Cronobacter sakazakii YRC3a pada susu formula
dengan berbagai suhu rekonstitusi (Modifikasi Fitriyah 2011)
Isolat BAL dan C. sakazakii isolat YRC3 terpilih, selanjutnya diikutsertakan pada uji kompetisi pada berbagai suhu rekonstitusi 50, 60, dan 70 oC, sedangkan isolat BAL dan C. sakazakii isolat YRC3 tunggal sebagai perlakuan kontrol. Untuk BAL kultur kering beku sebanyak 1 g disuspensikan kedalam 9 mL larutan buffer fosfat. Masing masing sebanyak 0,2 mL isolat BAL dari suspensi yang berisi 1010 CFU/mL dan 0,2 mL C. sakazakii YRC3 yang berisi 105 CFU/mL terpilih diinokulasikan pada 2,88 gram susu formula. Jumlah bakteri asam laktat dan C. sakazakii YRC3a pada sampel susu formula rekonstitusi masing-masing sekitar 108 dan 103 CFU/mL. Susu bubuk formula direkonstitusi dengan air steril sampai volumenya 20 mL di dalam erlenmeyer 50 mL. Rekonstitusi dilakukan pada suhu 50, 60, dan 70 oC. Selanjutnya susu formula rekonstitusi dijaga kondisinya pada suhu ruang sampai jam ke-8 hang time. Penghitungan jumlah total bakteri setelah rekonstitusi dilakukan setiap susu formula rekonstitusi mencapai hang time 0, 2, 4, 6, dan 8 jam. Penghitungan jumlah total masing-masing bakteri dilakukan pada masing-masing-masing-masing media selektif BAL pada media
selektif MRSA-AA dan C. sakazakii YRC3a pada media selektif TSAYE-SC. Kegiatan pengitungan jumlah masing-masing bakteri dikerjakan 2 kali pengulangan.
Jumlah awal BAL dan C. sakazakii YRC3asebelum rekonstitusi ditentukan melalui penghitungan jumlah total masing-masing bakteri. BAL kering beku masing-masing sebanyak 1 g disuspensikan pada 9 mL larutan buffer posfat. Selanjutnya terhadap suspensi BAL yang yang telah mengandung 1010 CFU/mL dilakukan pengenceran pada media buffer posfat sehingga diperoleh jumlah awal BAL sekitar 108 CFU/mL. Jumlah awal C. sakazakii YRC3a sebelum rekonstitusi ditentukan dengan mensuspensikan sebanyak 1 mL C. sakazakii YRC3a yang
telah diinkubasi selama 18 jam pada suhu 37 °C. Selanjutnya terhadap
C. sakazakii YRC3a dilakukan pengenceran pada media pengencer buffer posfat sehingga diperoleh jumlah awal sekitar 103 CFU/mL. Penghitungan jumlah awal BAL dan C. sakazakii YRC3a sebelum rekonstitusi dilakukan dengan metode tuang pada masing-masing media pertumbuhan yaitu MRSA dan TSA.
5. Metode Analisis
a) Derajat Keasaaman (pH) (AOAC 1994)
Sampel susu formula rekonstitusi (kontrol dan kompetisi) sebanyak 20 mL, dihomogenkan dan dibiarkan selama 1 menit. Selanjutnya diukur nilai pHnya dengan pH meter yang telah dikalibrasi dengan buffer pH 4,0 dan pH 7,0. Perubahan nilai pH diukur setiap susu formula rekontitusi mencapai masa hang time 0, 2, 4, 6, dan 8 jam. Nilai pH diukur sebanyak 2 kali ulangan dari jam ke-0 hingga jam ke-8 (selama hang time).
b) Perubahan Suhu
Sampel susu formula rekonstitusi (kontrol dan kompetisi) sebanyak 20 mL. Selanjutnya diukur perubahan suhu sampel susu formula rekonstitusi dengan termometer. Perubahan suhu diukur setiap susu formula rekontitusi mencapai masa hang time 0, 2, 4, 6, dan 8 jam. Kegiatan ini dilakukan sebanyak 2 kali ulangan.
c) Penghitungan Koloni (BAM 2001)
Jumlah koloni bakteri BAL dan C. sakazakii YRC3a dihitung setelah diinkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam. Koloni bakteri dapat dihitung dengan rumus Standard Plate Count sebagai berikut:
N = ΣC/ {[(1*n1) + (0,1*n2)+ ...]*(d)} Dimana : N = jumlah koloni per mL atau per gram produk
∑C = jumlah semua koloni yang dihitung dari 2 cawan n1 = jumlah cawan pada pengenceran pertama
n2 = jumlah cawan pada pengenceran kedua d = pengenceran pertama yang dihitung
Limit deteksi metode plating berkisar 25 hingga 250 koloni. Ketika dalam cawan terdapat koloni kurang dari 25, maka dalam pelaporannya dikatakan bahwa
jumlahnya <2,5x101 CFU/mL. Jika tidak ditemukan koloni dalam cawan hingga pengenceran terendah, maka pelaporannya sebanyak 1,0x101 CFU/mL. Namun, jika koloninya melebihi 250, maka dianggap sebagai TBUD (tidak bisa untuk
dihitung). Dengan demikian, hanya cawan yang jumlah koloninya berkisar 25 hingga 250 saja yang dapat dihitung sebagai jumlah koloni bakteri yang
diinokulasikan.
6) Analisis Data (Steel & Torrie 1980; Uyanto 2009)
Analisis statistika yang digunakan pada penelitian ini meliputi analisis deskriptif dan analisis kuantitatif.
a) Analisis deskriptif digunakan untuk mendeskripsikan hasil Pengujian sintas BAL terhadap proses pengeringan beku (freeze-drying), Kompetisi BAL dan Cronobacter sakazakii isolat YRC3a pada Berbagai Suhu Rekonstitusi 50, 60, dan 70 °C, perubahan nilai pH, dan suhu dianalisis dengan statistika deskriptif.
b) Rancangan Acak Lengkap (RAL) (Steel & Torrie 1980; Uyanto 2009)
Data hasil penapisan bakteri asam laktat berdasarkan sintas selama rekonstitusi suhu 50 oC dan kompetisi isolat BAL asal ASI dengan
Cronobacter sakazakii isolat YRC3a, dianalisis dengan menggunakan
softwear SPSS 16.0 dengan menggunakan model perancangan Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu faktor (Anova Single Factor) (Steel & Torrie 1980), dengan uji lanjut berganda Duncan (Duncan Multiple Range Test/DMRT) (Uyanto 2009). Model rancangan yang digunakan adalah sebagai berikut:
Y
ij= µ + τi+ εij
Keterangan :
Yij = Nilai pengamatan pada perlakuan ke-i dengan ulangan ke-j µ = Rataan umum populasi
τi = Pengaruh perlakuan ke-i, pada ulangan ke-j