Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada Februari sampai dengan April 2015 di unit pembenihan, kolam penelitian dan laboratorium Balai Penelitian Pemuliaan Ikan Sukamandi Subang, Jawa Barat.
Alat dan Bahan a. Ekstraksi DNA
Alat-alat yang digunakan dalam Isolasi DNA adalah micropipette (Thermo scientific), Centrifuge HM-150IV (HM), centrifuge sorvall (Thermo), vortex ma ximix II (Thermoline), inkubator, microtips, microtube, collection tube, GeneJET Genomic DNA Purifica tion Column, chiller on ice (IsoFreeze), chiller templa te (IsoFreeze), tubes rack (eppendorf), penggerus, timer, alat bedah, gloves, masker, pinset, spidol, kalkulator.
Bahan-bahan yang digunakan dalam ekstraksi DNA adalah sampel sirip ekor benih lele transgenik F3, kit ekstraksi DNA (GeneJet Genomic DNA Purifica tion kit, Thermo Scientific), nuclease free water (NFW), sodium hipochlorit 1% dan tisu.
b. Amplifikasi PCR (Polymerase Chain Reaction)
Alat-alat yang digunakan dalam amplifikasi PCR adalah mesin Thermal Cycler (ESCO), Thermal Cycler (BIO-RAD), micropipette (Thermo Scientific), chiller on ice (IsoFreeze), Chiller template (IsoFreeze), microtube, microtips, tubes ra ck (eppendorf), pinset, spidol, gloves, masker.
Bahan-bahan yang digunakan dalam amplifikasi PCR adalah DNA templa te, FastStart PCR Master Mix (Roche), primer forward ACTPhGH-F (5’- GTG TGT GAC GCT GGA CCA ATC -3’), primer reverse ACTPhGH2-R (5’- CGA TAA GCA CGC CGA TGC CCA TTT -3’) (Marnis dkk., 2013), nuclease free wa ter (Thermo Scientific), sodium hipochlorit 1%, tisu.
c. Elektroforesis
Alat-alat yang digunakan dalam elektroforesis adalah Mini Horizontal Elektroforesis (Cleaver scientific ltd), timbangan analitik (AND), Gel Doc (UVP), cetakan agar 30 mL, cetakan agar 60 mL, beaker glass (Pyrex), gelas ukur (Iwaki Pyrex), aluminium foil, hot plate (Wise stir), stirrer, micropipette (Thermo Scientific), tubes rack (eppendorf), microtips, chiller on ice (IsoFreeze), chiller templa te (IsoFreeze), Laboratory film (Parafilm), gloves, gunting, masker, komputer, kamera digital dan alat tulis.
Bahan-bahan yang digunakan dalam elektroforesis adalah GelRed Nucleic Acid Stra in 10.000x in water (Vivantis), 10X Tris-Acetate-EDTA (TAE) BUFFER (Ultra Pure Grade) (Vivantis), akuades, agarose (vivantis), gel agarose 2%, Amplikon, Marker 100-3000 bp (Vivantis), loading dye (Vivantis), tisu.
d. Performa Pertumbuhan
Alat-alat yang digunakan dalam pegamatan performa pertumbuhan adalah akuarium ukuran 60x40x40 cm, aerator, alat takar, sendok, hand counter, wadah plastik/toples, ember, alat grading, sifon, waring, kolam terpal, penggaris, timbangan digital, mikroskop, camera digital dan alat tulis.
Bahan-bahan yang digunakan dalam performa pertumbuhan adalah pakan ikan, garam, larva ikan lele transgenik F3 hasil perkawinan induk betina positif
pembawa transgen yang memiliki kode tagging 4749 dengan jantan positif kode tagging 1221, larva lele transgenik didaptkan dari perkawinan indukan non-transgenik.
Prosedur Penelitian
Transmisi Transgen (PhGH) Deteksi Transgen
a. Hewan Uji
Deteksi transgen dilakukan pada benih lele transgenik F3 berumur 1 bulan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Ikan lele transgenik yang diuji merupakan ikan yang membawa konstruksi gen pCcBA-PhGH (Dewi dkk., 2013). Ikan merupakan koleksi dari Balai Penelitian Pemuliaan Sukamandi. Kontruksi gen pCcBA-PhGH dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Konstruksi gen pCcBA-PhGH (Dewi dkk., 2013)
Ikan sampel merupakan benih dari indukan betina positif pembawa transgen PhGH sebanyak 30 ekor yang dipijahkan dengan jantan non-transgenik dan 26 induk jantan pembawa transgen disilangkan dengan betina non-transgenik. Sampel yang digunakan merupakan sirip ekor pada benih ikan lele transgenik F3 berumur 1 bulan. Transgen dicek pada 20 ekor benih dari setiap indukan yang dipijahkan.
b. Ekstraksi DNA
Deteksi gen PhGH dilakukan pada bagian sirip ekor benih ikan lele. DNA masing-masing sampel diekstraksi menggunakan Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purifica tion Kit dengan prosedur sesuai dengan protokol dari produk tersebut.
Prinsip kerja ekstraksi DNA secara ringkas terdiri dari lisis sel, presipitasi DNA, pengikatan DNA pada column, pencucian DNA dan pelarutan DNA.
c. Amplifikasi PCR (Polymerase Chain Reaction)
Amplifikasi PCR pada DNA genom hasil ekstraksi dilakukan menggunakan fast start PCR master kit (Roche, Germany) dengan menggunakan mesin Thermal Cycler. Komposisi bahan yang digunakan untuk amplifikasi PCR yaitu Nuclease Free Water 49 µL, Master mix ( kit fast start PCR ) 175 µL (10 pmol/µL), primer for ward (ACT 107) 28 µL, primer reverse (PhGH2) 28 µL. Maka total volume 280 µL dibagi 14 sampel sehingga masing-masing larutan terdiri dari 20 µL dan kemudian ditambahkan DNA genom sebanyak 5 µL pada masing-masing larutan.
Primer yang digunakan adalah ACTPhGH-F (5’- GTG TGT GAC GCT GGA CCA ATC -3’) dan ACTPhGH2-R (5’- CGA TAA GCA CGC CGA TGC CCA TTT -3’) (Marnis dkk., 2013) dengan ukuran fragmen 1500-bp. Proses PCR dilakukan dengan tahapan persiapan enzim (pre-denaturation) pada suhu 950C selama 3 menit, tahap denaturasi (denaturation) pada suhu 940C selama 30 detik, tahap penepelan primer (annealing) pada suhu 600C selama 1 menit, tahap pemanjangan rantai DNA (extention) pada suhu 720C selama 1 menit dengan
masing-masing tahap sebanyak 35 siklus. Tahapan terakhir yaitu final PCR pada suhu 720C selama 10 menit.
d. Elektroforesis
Hasil PCR (amplikon) dielektroforesis dengan Marker 100-3000 bp (vivantis) dan volume amplikon sebanyak 10 µL dicampurkan dengan loading dye sebanyak 2 µL, kemudian di-running menggunakan gel agarose (vivantis) 2 % dalam TAE Buffer 1x yang diberi pewarna DNA yaitu gel red (Nulceid acid stra in) dan di-running selama 50 menit dengan tegangan 100 volt. Kemudian hasil elektroforesis divisualisasi menggunakan Gel Doc (UV Transilluminator). Proses kegiatan penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1.
Analisis Data
Hasil elektroforesis divisualisasi Gel Doc (UV Transilluminator) untuk melihat sampel positif pembawa transgen PhGH. Data yang diperoleh kemudian dianalisis dengan menggunakan software EOS Utility dan ZoomBr owser a plica tion dan selanjutnya data diolah menggunakan program Excel MS. Office 2007 untuk mengetahui tingkat transmisi transgen dari lele transgenik F2 ke lele transgenik F3.
Performa Pertumbuhan Pemeliharaan Ikan
Ikan yang digunakan pada penelitian ini ialah ikan lele (Clarias ga riepinus) transgenik F3 hasil pemijahan ikan lele transgenik F2 yang merupakan koleksi dari Balai Penelitian Pemuliaan Ikan Sukamandi Subang, Jawa Barat. Pemeliharaan ikan dilakukan di kolam penelitian Balai Penelitian
Pemuliaan Ikan Sukamandi, Subang, Jawa Barat. Larva hasil pemijahan dipelihara dalam wadah akuarium dengan kepadatan 870 ekor/akuarium. Wadah berupa akuarium dengan ukuran 60x40x40 cm3 serta ketinggian efektif air 15 cm (volume air 24 liter).
Ikan dipelihara selama 21 hari dengan sistem aerasi dan pemberian pakan diberikan pada pagi, sore dan malam hari secara ad libitum (sekenyangnya) menggunakan pakan komersial berbentuk tepung dan remah halus dengan kadar protein 40% (HI-PRO-VITE PS-P dan BINTANG 581, PT Centralproteina Prima, Mojokerto).
Akuarium disifon setiap pagi sebelum peberian pakan dan air diganti sebanyak 50% setip 3 hari sekali. Penyifonan bertujuan untuk mempertahankan kualitas air agar tetap optimal teruama dari sisa pakan yang dapat memicu peningkatan kadar amonia dalam wadah pemeliharaan. Sampling dilakukan setiap 10 hari sekali dengan menghitung bobot total ikan.
Setelah 21 hari masa pemeliharaan, ikan dipindahkan kedalam media kolam terpal. Pemeliharaan selanjutnya dilakukan pada kolam terpal dengan ukuran 1 m2 dengan kepadatan 110 ekor/kolam. Ikan dipelihara selama 30 hari dengan pemberian pakan pada pagi, sore dan malam secara ad libitum (sekenyangnya) dengan menggunakan pakan komersial berbentuk butiran kasar dengan kadar protein berkisar 38-41% (PF800 dan PF 1000, PT. Matahari Sakti, Margomulyo). Sampling dilakukan setiap 15 hari sekali. Pada akhir pemeliharaan dihitung biomassa total ikan, tingkat konsumsi pakan dan kelangsungan hidup. Pengamatan terhadap performa pertumbuan ikan dilakukan selama 50 hari masa pemeliharaan.
Parameter Perumbuhan
a. Derajat Pembuahan dan Derajat Penetasan
Untuk mengetahui derajat pembuahan dan derajat nenetasan maka dihitung dengan menggunakan rumus (Wang dkk., 2011):
FR = ℎ �� �� ℎ�
ℎ �� � x 100%
HR = ℎ �� � �
ℎ �� �� ℎ� x 100% b. Laju Pertumbuhan Bobot
Untuk mengetahui laju pertumbuhan ikan, maka selanjutnya dilakukan pengukuran terhadap bobot total ikan selama pemeliharaan berlangsung. Pengukuran dilakukan setiap 10 hari sekali pada awal pemeliharaan dan 15 hari pada pemeliharaan lanjutan.
Kemudian dihitung laju pertumbuhan harian menggunakan rumus (Effendie, 1997):
g = � − �
x 100%
Keterangan:
g = Laju pertumbuhan harian individu (%)
Wt = Bobot rata-rata ikan uji pada akhir penelitian (gram) Wo = Bobot rata-rata ikan uji pada awal penelitian (gram) t = Lamanya penelitian (hari)
c. Tingkat Konsumi Pakan
Untuk mengetahui tingkat konsumsi pakan maka dilakukan beberapa perhitungan dengan mengacu pada rumus
(
Yuwono dkk., 2005):RKP = � �� Keterangan:
RKP = Rasio konversi pakan KP = Konsumsi pakan
PB = Penambahan bobot ikan KPH = �
�� Keterangan:
KPH = Konsumsi pakan harian KP = Konsumsi pakan
PB = Jumlah hari pemberian pakan Efisiensi pakan = �
�� Keterangan:
LPM = Pertambahan bobot/Jumlah hari pemberian pakan KPH = Konsumsi pakan harian
d. Tingkat Kelangsungan Hidup
Tujuan pehitungan Tingkat Kelangsungan Hidup adalah untuk mengetahui perbandingan tingkat kelangsungan hidup antara benih lele transgenik F3 dengan benih lele non-transgenik. Tingkat kelangsungan hidup dihitung dengan menggunakan rumus (Effendie, 1997):
SR = x 100%
Keterangan :
SR = Tingkat Kelangsungan Hidup
Nt = Jumlah ikan yang idup pada akhir penelitian No = Jumlah Ikan yang hidup pada awal penelitian
Analisis Data
Untuk mengetahui laju pertumbuhan dan distribusi ikan lele transgenik F3 maka data yang diperoleh setelah dilakukan pengukuran bobot ikan kemudian ditabulasi dan dianalisis menggunakan program Excel MS. Office 2007. Data laju pertumbuhan bobot dan pakan kemudian dianalisi menggunakan program Excel MS. Office 2007 dengan analisis F-Test Two-Sample for Variances dan apabila terdapat variasi yang besar selanjutnya dilakukan analisis t-Test: Two-Sa mple Assuming Unequa l Va ria nces p<0.05 untuk mengetahui perbedaan laju pertumbuhan dan tingkat konsumsi pakan dari lele transgenik dan non-transgenik.
Pengukuran Kualitas Air
Selama pemeliharaan berlangsung, dilakukan pengukuran terhadap parameter pendukung berupa kualitas air. Parameter pendukung yang diukur meliputi suhu, pH, DO dan turbiditas (kekeruhan) dengan menggunakan WQC (Water quality checker). Uji kadar amonia menggunakan metode fenat spektrofotometri (SNI 66-6989.30-2005) (Lampiran 2) dan nitrit menggunakan metode sulfalinamid spektrofotometri (SNI 06-6989.9-2004) (Lampiran 3).