Pemurnian enzim protease melalui beberapa tahapan. Tahapan pertama adalah memproduksi enzim protease bebas sel. Sel bakteri dipisahkan dari
larutan fermentasi secara mikrofiltrasi. Tahapan kedua adalah pemurnian secara ultrafiltasi, lalu dilanjutkan dengan presipitasi. Tahapan terakhir proses pemurnian ini adalah kromatografi kolom yang menggunakan teknik kromatografi penukar ion. Secara skematis metodologi penelitian ini dapat dilihat pada gambar 3.
Gambar 3. Skema metode penelitian
1. Produksi enzim protease kasar bebas sel
Produksi enzim dilakukan dalam fermentor LKB sebanyak 30 L. Produksi ini dilakukan dengan menggunakan media 2 % tetes tebu dan 1 % urea pada pH 7,5 dan suhu 37 oC. Sel bakteri dipisahkan dari larutan enzim dengan menggunakan mikrofilter membran keramik serat berongga (ceramics hollow fibre) dengan pori berukuran 0,01 μm.
P
permeate Manometer
Pompa Flowmeter
Membran keramik serat berongga
Gambar 4. Skema proses peralatan mikrofiltrasi
2. Ultrafiltrasi
Membran ultrafilter yang digunakan dalam penelitian ini berukuran 30.000 Dalton molecular weight cut off (MWCO). Proses ultrafiltrasi akan menggunakan membran tipe plat yang mempunyai luasan membran 60 cm2. Tekanan yang diberikan sama untuk setiap perlakuan yaitu 100 kPa. Umpan berasal dari permeate yang didapat dari proses mikrofiltrasi. Setiap penurunan 150 ml retentat yang terkumpul dicatat volume retentat tersisa, volume permeat, unit aktivitas enzim dan kadar protein enzim, sedangkan permeat dibuang. Fluks dicatat setiap sebelum proses ultrafiltrasi berlangsung.
Gambar 5. Skema proses peralatan ultrafiltrasi
3. Presipitasi bertingkat
a. Protease hasil ultrafiltrasi ditempatkan ke dalam labu erlenmeyer dan dikondisikan suhunya menjadi 4 oC menggunakan balok es.
b. Penambahan larutan amonium sulfat 30 % (b/v) jenuh dilakukan dengan pengadukan dan dituang sedikit demi sedikit ke dalam larutan protein. Volume larutan amonium sulfat jenuh yang terbentuk dicatat. Proses pengadukan membutuhkan waktu ± 60 menit, kemudian disimpan pada suhu 4 oC selama semalam untuk menyempurnakan pengendapan.
c. Endapan yang dihasilkan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000xg/15 menit. Endapan kemudian dipisahkan dari cairannya. Cairan yang tersisa dicatat volumenya dan dilakukan presipitasi kembali dengan menggunakan prosedur yang sama tetapi konsentrasi amonium sulfat yang lebih tinggi. Jumlah amonium sulfat yamg ditambahkan berdasarkan Lampiran 14. Konsentrasi amonium sulfat yang digunakan adalah 30 % -70 % amonium sulfat jenuh.
d. Tiap contoh yang dihasilkan pada tahap ini diukur unit aktivitas enzim dan kadar protein enzim.
4. Kromatografi penukar ion
Ada dua tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan separasi protein-protein dalam kromatografi kolom “Akta Prime”, yaitu penghilangan garam-garam dengan menggunakan “Hi trap desalting” dan penukar ion. Laju alir yang digunakan adalah 1 ml/menit.
Gambar 6. Alat kromatografi kolom “Akta Prime”
1. Penghilangan garam-garam
a. Penyiapan contoh
Contoh dilewatkan melalui filter berukuran 0,45 µm. Volume contoh maksimal yang direkomendasikan dengan menggunakan kolom kromatografi ”HiTrapTM desalting” berukuran 5 ml adalah 1,8 ml.
b. Penyiapan penyangga
Untuk memastikan hasil terbaik digunakan air dan bahan-bahan kimia dengan kadar kemurnian tinggi. Hal ini bertujuan untuk menyaring penyangga dengan melewatkannya melalui filter 0,45 µm sebelum digunakan.
Penyangga (portal A1) : sodium fosfat 20 mM, NaCl 0,15 M, pH 7. Sedikitnya 500 ml larutan penyangga disiapkan.
c. Pengaturan pemurnian
a) Pipa pemasukkan diletakkan pada portal A1 (8 katup portal) dan portal B (2 katup portal) di dalam penyangga. Tiga pipa
pengeluaran berwarna coklat diletakkan di dalam saluran pembuangan.
b) Kolom antara portal 1 disambungkan pada katup injeksi (7 katup portal dan saluran UV).
c) Rak pengumpul fraksi diisi dengan tabung 18 mm (min 25) dan plat putih ditempatkan pada cabang fraksinasi yang berlawanan dengan tabung pertama.
d) Contoh dihubungkan antara portal 2 dan 6 dengan katup injeksi dengan putaran (loop) yang cukup besar bagi contoh. Bila superloop dibutuhkan tambahan informasi yang dibutuhkan tersedia dalam petunjuk untuk superloop.
e) Jarak diatur antara dua saluran pada pencatat ke IV dan kecepatan hingga 10 mm/min.
d. Pendeteksian contoh
a) Pencatat diperiksa apakah diatur berdasarkan petunjuk dan siap dioperasikan.
b) Volume contoh dimasukkan dan tekan OK untuk memulai perhitungan/analisa.
2. Penukar ion
a. Penyiapan contoh
Contoh dilewatkan melalui filter berukuran 0,45 µm. Volume sampel maksimal yang direkomendasikan dengan menggunakan kolom berukuran 1 ml adalah 0,9 ml.
b. Penyiapan penyangga
Untuk memastikan hasil terbaik digunakan air dan bahan-bahan kimia dengan kadar kemurnian tinggi. Hal ini bertujuan untuk menyaring penyangga dengan melewatkannya melalui filter 0,45 µm sebelum digunakan.
Penyangga (portal A1) : Tris-Cl 20 mM, NaCl 1 M, variasi pH 5,5; 6,0; 7,0; dan 8,0. Sedikitnya 500 ml larutan penyangga disiapkan.
c. Pengaturan pemurnian
a) Pipa pemasukkan diletakkan pada portal A1 (8 katup portal) dan portal B (2 katup portal) di dalam penyangga. Tiga pipa pengeluaran berwarna coklat diletakkan di dalam saluran pembuangan.
b) Kolom antara portal 1 disambungkan pada katup injeksi (7 katup portal dan saluran UV).
c) Rak pengumpul fraksi diisi dengan tabung 18 mm (min 25) dan plat putih ditempatkan pada cabang fraksinasi yang berlawanan dengan tabung pertama.
d) Contoh dihubungkan antara portal 2 dan 6 dengan katup injeksi dengan putaran (loop) yang cukup besar bagi contoh. Bila superloop dibutuhkan tambahan informasi yang dibutuhkan tersedia dalam petunjuk untuk superloop.
e) Jarak diatur antara dua saluran pada pencatat ke IV dan kecepatan hingga 10 mm/min.
e. Pendeteksian contoh
a) Pencatat diperiksa apakah diatur berdasarkan petunjuk dan siap dioperasikan.
b) Volume contoh dimasukkan dan tekan OK untuk memulai perhitungan/analisa.
5. Penentuan Aktivitas Enzim
Aktivitas enzim diukur menggunakan metode Walter (1988) dimodifikasi.
Tabel 2. Metode analisis aktivitas enzim proteasea
Pereaksi Contoh (μl) Blanko (μl) Standar (μl) Kasein (1%) dalam larutan
penyangga Tris-Cl pH 8
400 400 400
Enzim dalam CaCl2 (2mM) 50 - -
Air suling - 50 -
Tirosin standar (5mM) - - 50 Inkubasi selama 10 menit pada suhu 30oC
TCA (0.1 mol/l) 500 500 500 Enzim dalam CaCl2 (2
mmol/l)
- 50 50
Air suling 50 - -
Inkubasi selama 10 menit pada suhu 37oC dan dilanjutkan dengan sentrifuse pada 4000 rpm selama 20 menit
Filtrat 400 400 400
Na2CO3 (0,15 mol/l) 2000 2000 2000 Pereaksi folin 400 400 400
Inkubasi selama 20 menit pada suhu 37oC, kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm a) Walter, 1988
Unit aktivitas enzim adalah jumlah enzim yang menghasilkan produk yang setara dengan 1 μmol tirosin per menit pada suhu 37oC dan pH 8. Cara menghitung unit aktivitas enzim adalah sebagai berikut. Setiap yang akan dihitung unit aktivitasnya mempunyai nilai absorban untuk contoh, blanko, dan standar masing-masing, dengan menggunakan rumus di bawah ini dapat dihitung unit aktivitas dari enzim.
U= T xPx A A A A b st b sp 1 1 1 − −
Keterangan :
U : unit aktivitas protease per ml per menit (U/ml/menit) Asp : nilai absorbansi contoh
Ast : nilai absorbansi standar Abl : nilai absorbansi blanko P : faktor pengenceran T : waktu inkubasi (menit)
6. Penentuan kadar protein(Bradford, 1976)
40 μl cairan ditambahkan 2 ml pereaksi Bradford (Lampiran 2), kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Absorbansinya diukur pada panjang gelombang 595 nm.
Standar yang digunakan adalah standar protein Bovine Serum Albumin (BSA) dengan konsentrasi 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,7; 0,9 (Lampiran 3) dan 1 mg/ml, sedangkan blanko yang digunakan adalah air suling. Protein yang diperoleh dinyatakan dalam satuan mg/ml.
7. Penentuan fluks
Fluks (J) adalah jumlah filtrat atau permeat (v) yang keluar per satuan luas (A) per satuan waktu (t).
Perhitungan : fluks (J) = ) ( ) ( A membran luas Q alir laju