Bahan dan Alat
Bahan baku utama yang digunakan dalam pembuatan TPUM adalah pisang uli. Pisang uli ini diperoleh dari pedagang pisang di Kabupaten Bogor. Pisang uli yang digunakan adalah pisang uli yang sudah tua namun masih berwarna hijau. Bahan baku dalam pembuatan yogurt antara lain susu skim, gula pasir, TPUM, isolat starter yogurt (L.bulgaricus dan S.thermophilus) dan kultur probiotik (L.acidophilus dan B.bifidum). Kultur starter dan probiotik diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB. Bahan enkapsulan yang digunakan adalah natrium alginat food grade yang diperoleh dari Pasar Senen Jakarta dan tepung sagu aren dari Pasar Bogor. Bahan kimia yang digunakan untuk analisis antara lain air destilata (akuades), CaCl2, alkohol 70%, spiritus, larutan buffer fosfat KH2PO4, glukosa, buffer fosfat pH 4, larutan NaOH 0.1 N standar, indikator PP (fenoftalein), dan bahan kimia untuk analisis lainnya. Media pertumbuhan bakteri asam laktat yang digunakan adalah media MRSA (de Man Rogosa Sharpe Agar) dan MRSB (de Man Rogosa and Sharpe Broth).
Peralatan yang digunakan dalam pembuatan TPUM antara lain, timbangan, erlenmeyer 1000 ml, pemanas bertekanan (otoklaf), oven, disc mill, refrigerator,
dan pengayak otomatis 100 mesh. Peralatan yang digunakan dalam pembuatan yogurt adalah water bath, homogenizer (mixer emulsifier), vorteks, refrigerator,cabinet dryer, inkubator suhu 37°C, jar anoksomat, dan anoksomat. Peralatan yang digunakan untuk analisis kimia adalah neraca analitik, cawan petri, tabung reaksi, mikropipet, tip, bunsen, syringe, buret, gelas piala, sentrifus, erlenmeyer, labu takar, desikator, laminar, pH meter, termometer dan peralatan lain untuk analisis.
Metode
Penelitian dilakukan dalam beberapa tahap yaitu pembuatan tepung pisang uli modifikasi (TPUM), pembuatan yogurt dengan substitusi TPUM, enkapsulasi probiotik (L.acidophilus dan B.bifidum) dengan enkapsulan alginat dan sagu aren, dan tahap aplikasi probiotik terenkapsulasi pada yogurt TPUM sinbiotik. Yogurt TPUM sinbiotik tanpa enkapsulasi adalah probiotik yang tidak dienkapsulasi. Yogurt TPUM sinbiotik ini kemudian dianalisis dengan analisis mikrobiologi, kimia dan sensori. Diagram alir penelitian secara keseluruhan disajikan pada Gambar 5.
Gambar 5. Diagram alir penelitian
Penambahan probiotik terenkapsulasi pada yogurt
TPUM
Yogurt TPUM sinbiotik
Analisis :
1. Uji mikrobiologi : ketahanan probiotik pada yogurt TPUM sinbiotik selama penyimpanan pada suhu rendah (0,2,4,5,6,7, dan 8 minggu)
2. Uji kimia : pH yogurt dan total asam tertitrasi (TAT) yogurt
3. Evaluasi sensori : aroma, rasa, tekstur, penerimaan keseluruhan pada minggu ke 0,4,dan 5 Pembuatan Tepung pisang uli
modifikasi (TPUM)
Pembuatan yogurt TPUM dengan substitusi 70%
Yogurt TPUM
Enkapsulasi probiotik L.acidophilus dan B.bifidum denganalginat dan sagu
aren.
Kontrol : tanpa enkapsulasi
Probiotik terenkapsulasi dan tanpa enkapsulasi
Pembuatan Tepung Pisang Uli Modifikasi
Tepung Pisang Uli Modifikasi (TPUM) dibuat dengan menggunakan pisang uli yang sudah tua namun kulitnya masih hijau. Pisang uli diiris tipis menjadi bentuk chips setebal 5-6 mm. Pisang ini kemudian difermentasi secara spontan dengan cara direndam dengan akuades steril di dalam erlenmeyer. Perbandingan pisang dan air adalah 3:4. Fermentasi spontan dilakukan pada suhu ruang selama 24 jam. Setelah fermentasi 24 jam, irisan pisang uli ini ditiriskan dan di otoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Pisang yang sudah diotoklaf lalu didinginkan pada suhu 4oC selama 24 jam. Irisan pisang kemudian dikeringkan dalam cabinet dryer (oven pengering) pada suhu 50-60oC sampai kadar air mencapai 8-12%. Setelah kering, irisan pisang dihaluskan menggunakan disc mill dan diayak menggunakan saringan 100 mesh. Tahapan pembuatan TPUM ini disajikan pada Gambar 6. TPUM tersebut kemudian digunakan untuk mensubstitusi susu skim pada pembuatan formula yogurt sebanyak 70%.
Gambar 6. Diagram alir proses pembuatan TPUM (modifikasi Abdillah 2010)
Pisang Uli Pengirisan 5-6 mm
Perendaman pisang dengan akuades steril (3:4) Fermentasi spontan t= 24 jam suhu ruang
Penirisan
Pemanasan bertekanan (otoklaf) T = 121oC, t=15 menit Pendinginan T= 4-10oC, t=24 jam
Pengeringan oven T= 50-60oC (k.a = 8-12%) Penghalusan (disc mill)
Pengayakan (100 mesh) TPUM (Tepung pisang uli
Enkapsulasi Probiotik
Pembuatan kultur kerja probiotik L.acidophilus dan B.bifidum dilakukan dengan cara sebagai berikut. Kultur probiotik dari agar tusuk diambil 1-2 ose kemudian diinokulasikan pada media MRSB yang dicampur dengan 0.2% yeast ekstrak dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam sehingga menghasilkan kultur induk. Kultur induk sebanyak 1% ditambahkan ke dalam larutan 10% susu skim yang dicampur dengan 3% glukosa bubuk kemudian diinkubasi pada suhu 27oC selama 24 jam sehingga menghasilkan kultur kerja probiotik. Untuk mencegah terjadinya kontaminasi, larutan susu skim yang akan digunakan telah disterilisasi pada suhu 121oC selama 15 menit. Setelah diinkubasi selama 24 jam, kultur kerja probiotik siap digunakan untuk pembuatan enkapsulan.
1) Enkapsulasi probiotik teknik ekstrusi dengan alginat
Kultur kerja probiotik dicampurkan dengan suspensi alginat. Suspensi alginat dibuat dengan melarutkan alginat ke dalam air (3% w/v) kemudian disterilisasi pada suhu 121oC selama 15 menit. Kultur kerja probiotik berumur 24 jam sebanyak 20 ml dimasukkan ke dalam 100 ml larutan Na-alginat steril. Campuran suspensi alginat dan kultur kerja probiotik ini dikocok hingga homogen, disebut sebagai suspensi biopolimer-sel. Suspensi biopolimer sel dimasukan ke dalam syringe steril berukuran 10 ml dan diteteskan ke dalam larutan CaCl2 0,1 M steril (perbandingan suspensi biopolimer sel dan CaCl2 0,1 M adalah 1:3) dengan jarak tetes 1 cm. Pengerasan gel dilakukan selama 30 menit. Manik-manik disaring dan dibilas menggunakan NaCl 0,85% yang telah disterilisasi serta akuades steril. Manik-manik basah kemudian dimasukkan ke dalam wadah atau botol steril dan disimpan di dalam refrigerator selama semalam untuk menstabilkan enkapsulan. Jumlah sel yang terenkapsulasi di dalam manik- manik dihitung dengan metode total BAL (BAM 2001).
2) Enkapsulasi probiotik teknik ekstrusi dengan sagu aren
Larutan sagu aren dibuat dengan cara melarutkan sagu aren ke dalam air kemudian dipanaskan sambil diaduk sehingga membentuk konsistensi kental (tergelatinisasi). Larutan sagu aren yang sudah mengental kemudian didinginkan hingga suhu sekitar 37oC. Prosedur enkapsulasi probiotik menggunakan enkapsulan sagu aren hampir sama dengan alginat. Untuk mengetahui konsentrasi larutan sagu aren yang optimal untuk pembuatan enkapsulasi probiotik, maka larutan sagu aren dibuat dengan beberapa konsentrasi. Konsentrasi larutan sagu aren yang diujikan adalah konsentrasi 12%, 15% dan 20%. Kultur probiotik sebanyak 20 ml dimasukkan ke dalam 100 ml larutan sagu aren. Suspensi ini kemudian dimasukkan ke dalam syringe dan diteteskan ke dalam akuades steril dingin. Manik-manik disaring dan dibilas dengan akuades steril. Manik-manik
basah kemudian dimasukkan ke dalam wadah atau botol steril dan disimpan di dalam refrigerator selama semalam untuk menstabilkan enkapsulan. Jumlah sel yang terenkapsulasi di dalam manik-manik dihitung dengan metode total BAL (BAM 2001).
Pembuatan Yogurt TPUM Sinbiotik dengan aplikasi enkapsulasi probiotik
Gambar 7. Diagram proses pembuatan yogurt TPUM sinbiotik dengan enkapsulan
Kultur starter yogurt dibuat dengan cara mengambil 1-2 ose dari kultur L.bulgaricusdan S.thermophillus pada media agar kemudian diinokulasikan pada media MRSB yang dicampur dengan 0.2% yeast ekstrak. Kultur ini diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam sehingga menghasilkan kultur induk. Kultur induk
Pencampuran dan pengadukan Homogenisasi
Pasteurisasi suhu 90oC selama 30 menit
Pendinginan hingga suhu 37oC
Penginokulasian kultur starter 2%
Fermentasi (37oC selama 24 jam)
Yoghurt TPUM
Pasteurisasi suhu 90oC selama 30 menit
Penginokulasian probiotik terenkapsulasi
(108 CFU/ml) Yoghurt TPUM sinbiotik Penyimpanan dingin 4-10oC 10% Susu skim dan TPUM (3:7)
sebanyak 1% ditambahkan ke dalam larutan 10% susu skim yang dicampur dengan 3% glukosa bubuk kemudian diinkubasi pada suhu 27oC selama 24 jam sehingga menghasilkan kultur kerja. Untuk mencegah terjadinya kontaminasi, larutan susu skim yang akan digunakan telah disterilisasi pada suhu 121oC selama 15 menit. Setelah diinkubasi selama 24 jam, kultur kerja siap digunakan untuk produksi pembuatan yogurt. Kultur starter yogurt ditambahkan ke dalam yoghurt sebanyak 2% dengan perbandingan L.bulgaricus dan S.thermophillus adalah 1:1.Yogurt yang dibuat dalam pembuatan yogurt TPUM sinbiotik ini merupakan stirred yogurt. Tahap awal pembuatan stirred yogurt ini adalah pencampuran susu skim dan TPUM (30:70) dengan akuades steril serta gula 5%. Setelah bahan pembuatan yogurt tercampur merata, larutan tersebut kemudian dihomogenisasi dengan menggunakan homogenizer untuk menyeragamkan ukuran partikelnya. Homogenizer diatur pada skala 4 selama 5 menit. Setelah dihomogenisasi, larutan dipasteurisasi pada suhu 90oC selama 30 menit. Larutan tersebut kemudian didinginkan hingga suhu sekitar 37oC. Tahap selanjutnya adalah inokulasi dengan kultur starter yogurt sebanyak 2% sambil diaduk. Perbandingan kultur L.bulgaricus dan S.thermopilus adalah 1:1. Lama inkubasi ini selama 24 jam pada suhu 37°C. Setelah inkubasi selesai, yogurt kembali dipasteurisasi untuk menginaktivasi kultur starternya. Tahap pembuatan yogurt TPUM sinbiotik disajikan pada Gambar 7.
Yogurt yang telah dipasteurisasi dan didinginkan, selanjutnya ditambahkan probiotik terenkapsulasi dengan perbandingan 1:3 (Gambar 8).
Gambar 8. Perbandingan jumlah enkapsulan dan yogurt
Yogurt ini disiapkan dalam 6 seri sampel berbeda, yaitu yogurt dengan enkapsulan probiotik L.acidophilus alginat, dan sagu aren serta yogurt dengan enkapsulan probiotik B.bifidum alginat, dan sagu aren. Yogurt dengan probiotik L.acidophilus dan B.bifidum tanpa enkapsulasi adalah kontrol. Produk disimpan selama 8 minggu pada suhu rendah (4-10oC) dan dianalisis total BAL, pH, TAT dan karakteristik sensorinya.
¾ yogurt ¼ enkapsulan
ANALISIS
Analisis Total BAL (BAM 2001)
Analisis mikrobiologi dengan menggunakan metode total bakteri asam laktat ini adalah untuk mengetahui ketahanan probiotik setelah dienkapsulasi dan disimpan selama 8 minggu. Pengujian ini dilakukan pada sampel yogurt TPUM sinbiotik yang telah disimpan dalam suhu 4-8oC selama penyimpanan 0, 2, 4, 5, 6, 7 dan 8 minggu. Probiotik yang telah dienkapsulasi diharapkan dapat memberikan umur simpan yang lebih lama hingga 8 minggu.
Sampel diambil dari yogurt dan enkapsulan yang telah dihaluskan dalam stomacher terlebih dahulu hingga halus. Hal ini dilakukan untuk melepaskan bakteri probiotik yang terjerat dalam manik-manik. Sampel yang telah dihaluskan kemudian ditimbang secara aseptis ke dalam gelas piala steril sebanyak 10 gram. Pengencer buffer fosfat KH2PO4 steril pH 6,8 sebanyak 90 ml dimasukkan ke dalam gelas piala yang berisi sampel yogurt sehingga diperoleh pengenceran 10-1. Sampel diaduk hingga homogen kemudian diencerkan kembali hingga pengenceran 10-4, 10-5, 10-6, dan 10-7. Pada pengenceran tersebut, sampel diinokulasi ke dalam cawan petri secara duplo. Metode pencawanan yang digunakan adalah metode agar tuang dengan MRSA. MRSA dituang sebanyak 12- 15 ml ke dalam cawan petri yang berisi kultur dan diratakan dengan cara memutar cawan lalu dibiarkan membeku. Inokulasi media MRSA harus dilakukan dalam waktu 15-30 menit pada periode persiapan pengenceran. Setelah membeku, cawan diinkubasikan dengan posisi terbalik pada suhu 37oC selama 48 jam. Untuk bakteri asam laktat anaerob fakultatif seperti B.bifidum, inkubasi dilakukan secara anaerob dengan menggunakan anoksomat. Setelah inkubasi, koloni dihitung dalam kisaran 15-300 koloni (ISO 7889:117). Jumlah koloni dicatat dan dihitung dengan rumusan sebagai berikut:
� = ∑�
�1 + 0.1�2 ��
Keterangan:
N : Jumlah koloni (CFU) per ml atau gram produk Σ C : Total seluruh koloni pada cawan yang dapat dihitung n1 : Jumlah cawan dari pengenceran pertama yang dihitung n2 : Jumlah cawan dari pengenceran kedua yang dihitung
d : Nilai pengenceran dari cawan pada pengenceran yang dapat dihitung
Kadar Air TPUM (AOAC 1999)
Pengukuran kadar air didasarkan pada prinsip banyaknya kandungan air yang terdapat di dalam sampel, yang dapat dilihat dari perbedaan berat sampel yang hilang sebelum dan sesudah dikeringkan dalam oven. Cawan kosong dimasukkan ke dalam oven suhu 105°C selama 15 menit untuk menghilangkan
kandungan airnya lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Sebanyak 1-2 gram sampel TPUM ditimbang dalam cawan. Cawan yang telah berisi sampel dimasukkan ke dalam oven selama 6 jam. Setelah 6 jam, cawan didinginkan di dalam desikator dan ditimbang kembali. Cawan dikeringkan kembali hingga diperoleh bobot kering sampel yang konstan. Pengukuran dilakukan sebanyak 2 kali ulangan secara duplo. Cara perhitungan kadar air berat kering dan berat basah terdapat pada rumus berikut ini :
Kadar air % berat kering = (W1 – W2) x 100% W2
Kadar air % berat basah = (W1-W2) x 100% W1
Keterangan :
W1 = bobot sampel sebelum dikeringkan (gram) W2 = bobot sampel setelah dikeringkan (gram)
Pengukuran pH (AOAC 1999)
Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan alat pH-meter. Sebelum digunakan, alat pH meter distandarisasi terlebih dahulu menggunakan larutan buffer pH 4 dan pH 7. Sekitar 25 ml sampel yogurt TPUM sinbiotik yang telah distomacher, dimasukkan ke dalam gelas piala. Elektroda pH-meter dicelupkan ke dalam sampel, kemudian dilakukan pembacaan pH sampel hingga mencapai nilai yang tetap. Pengukuran pH dilakukan setiap minggu ke-0,2,4,5,6,7 dan 8 secara duplo.
Total Asam Tertitrasi (modifikasi AOAC 1999)
Pengukuran asam tertitrasi dilakukan dengan prinsip titrasi asam basa. Sampel yang memiliki asam dititrasi dengan menggunakan NaOH 0.1 N. NaOH tidak dapat dipakai sebagai standar primer karena NaOH bersifat higroskopis, oleh sebab itu NaOH harus distandardisasi terlebih dahulu dengan menggunakan larutan KHP (Potassium hydrogen phthalate). KHP sebanyak 1 gram ditimbang kemudian dilarutkan dengan 50 ml akuades. Larutan KHP diaduk rata dan diberi 3 tetes indikator fenoftalein 1% sebanyak 3 tetes. Larutan KHP dititrasi dengan larutan NaOH 0.1 N hingga terbentuk warna merah muda. Volume NaOH yang terpakai dicatat, kemudian normalitas NaOH dapat diketahui dengan menggunakan rumus berikut :
N NaOH = bobot KHP (gram)
BM KHP (204.228 g/mol) x volume NaOH terpakai (L)
Analisis total asam tertitrasi menggunakan sampel yogurt yang telah dihaluskan dengan menggunakan stomacher. Sampel ditimbang sebanyak 10
gram kemudian ditepatkan hingga 100 ml dengan menggunakan akuades dan labu takar. Sampel yang telah ditepatkan kemudian disaring dengan menggunakan kertas saring. Sampel dimasukkan sebanyak 25 ml ke dalam erlenmeyer 100 ml kemudian ditambahkan 3 tetes indikator fenolftalein 1%. Sampel diaduk rata dan dititrasi dengan larutan NaOH 0.1 N yang telah distandarisasi sampai terbentuk warna merah muda. Tepat saat warna merah muda terbentuk, titrasi dihentikan. Total asam tertitrasi dinyatakan sebagai persen asam laktat (BM asam laktat = 90,08).
% asam laktat = V NaOH x N NaOH x 100/25 (FP) x BM asam laktat x100% W sampel (mg)
Analisis Sensori (Kemp Sarah 2009)
Analisis sensori menggunakan uji deskriptif untuk penetapan karakteristik sensori produk awal, dan mengetahui perubahan produk secara sensori selama penyimpanan. Uji ini menggunakan panelis terlatih sebanyak 9 orang. Pertimbangan dalam pemilihan panelis terlatih ini adalah panelis mengetahui karakteristik yogurt TPUM sinbiotik dengan baik karena telah dilakukan proses pelatihan terlebih dahulu, panelis mengetahui dan mengikuti perubahan produk selama masa penyimpanan, koordinasi dan penanganan lebih mudah, sampel yang dibuat tidak terlalu banyak sehingga mengurangi biaya.
Uji deskriptif kuantitatif dilakukan dua tahap yaitu tahap pelatihan panelis dan tahap pengujian produk. Tahap pelatihan panelis dilakukan dengan metode diskusi kelompok (focus group discussion). Tujuan uji ini adalah untuk menggali karakteristik produk dari panelis, pelatihan pengisian score sheet, dan menyamakan persepsi panelis terhadap karakteristik produk awal (minggu 0) sehingga panelis nantinya dapat menilai perubahan produk yang terjadi selama penyimpanan. Pada tahap ini panelis juga disuguhkan produk yang fresh dan sudah rusak sehingga panelis dapat membedakan keduanya dan menilai perubahan karakteristik produk selama penyimpanan. Setelah tahap diskusi kelompok, tahap pengujian produk dilakukan secara individu oleh panelis. Uji ini dilakukan dengan metode deskriptif kuantitatif untuk mengetahui intensitas perubahan dari masing-masing atribut sensori yang diuji. Skala yang digunakan adalah skala garis sepanjang 15 cm (Lampiran 48). Skala ini dipilih karena skala garis lebih mempermudah panelis melakukan penilaian. Pada perhitungan dan interpretasi data, nilai skala garis dikonversi pada skala kategori sehingga diperoleh interpretasinya (Lampiran 50). Selain uji deskriptif, munculnya aroma alkohol sebagai indikasi kerusakan yogurt juga diuji dengan menggunakan skala kategori. Pengujian sensori dengan uji deskriptif diolah dengan menggunakan uji ANOVA pada program IBM SPSS Statictics 21. Scoresheet pengujian sensori disertakan pada Lampiran 48.
Rancangan Percobaan
Yogurt TPUM sinbiotik dengan enkapsulan terbaik selama penyimpanan suhu rendah ditentukan dengan menggunakan rancangan acak kelompok lengkap faktorial dengan tiga faktor perlakuan yaitu penggunaan jenis enkapsulan (kode E), jenis probiotik (kode P) dan lama penyimpanan (S).
Faktor jenis enkapsulan terdiri dari tiga taraf, yaitu E1 = sagu aren, E2 = alginate, dan E3 = tanpa enkapsulasi. Faktor jenis probiotik terdiri dari dua taraf, yaitu P1 = B.bifidum, dan P2 = penambahan L.acidophilus. Faktor lama penyimpanan terdiri dari tujuh taraf yaitu S0 = minggu ke-0, S1 = minggu ke-2, S2 = minggu ke-4, S3 = minggu ke-5, S4 = minggu ke-6, S5 = minggu ke-7, dan S6 = minggu ke-8.
Masing-masing perlakuan dilakukan dua kali ulangan. Model linear rancangan acak kelompok lengkap faktorial yang digunakan adalah sebagai berikut:
Yij = µ +Ei + Pj + Sk + (EP)ij + (ES)ik + (PS) jk + (EPS)ijk + κl + έijk Keterangan :
Yij =nilai pengamatan pada perlakuan enkapsulasi probiotik, jenis bakteri dan lama penyimpanan yang digunakan.
µ = nilai rataan umum
Ei = pengaruh perlakuan jenis enkapsulan taraf ke-i Pj = pengaruh perlakuan jenis probiotik taraf ke-j Sk = pengaruh perlakuan lama penyimpanan taraf ke-k
EPij = pengaruh interaksi taraf ke-i faktor P dan taraf ke-j faktor W ESik = pengaruh interaksi taraf ke-i faktor P dan taraf ke-k faktor A PSjk = pengaruh interaksi taraf ke-j faktor W dan taraf ke-k faktor A
(EPS)ijk = pengaruh interaksi taraf ke-i faktor P, taraf ke-j faktor W dan taraf ke-k faktor A
έijk = Galat (Error) i = jenis enkapsulan
j = jenis bakteri asam laktat (BAL) k = lama penyimpanan yogurt l = ulangan I dan ulangan II
Analisis Statistika
Data hasil analisis kadar air, viabilitas bakteri asam laktat, nilai pH dan TAT, serta analisis sensori dianalisis dengan menggunakan program Microsoft Excel 2007 dan program IBM SPSS Statistik 21.0. Data hasil analisis viabilitas bakteri asam laktat diolah menggunakan program IBM SPSS Statistik 21.0 dengan analisis ragam ANOVA (Analysis of Variance) mode dengan analisis General Linear Model Univariate pada taraf nyata 5%. Jika terdapat perbedaan yang nyata maka akan dilanjutkan dengan uji Duncan pada taraf nyata 5% (Steel dan Torrie 1995).